细菌生物膜参与炎症性肠病发病的研究进展*

史少培 汪芳裕

南京医科大学金陵临床医学院消化内科(210002)

随着工业化的发展与饮食逐渐西方化，我国炎症性肠病(IBD)的发病率逐年升高。目前IBD的发病机制尚不明确，遗传基因、肠道屏障受损、菌群失调等多种因素参与其发病过程。有研究结果显示，诱发IBD的病原体并非某种单一的致病菌，而是由多种病原微生物构成的肠道细菌群落，这种微生物的聚集体称为细菌生物膜。IBD患者肠道屏障受损，细菌易穿透黏液层直接与肠上皮接触并定植形成生物膜，造成肠道炎症[1]。本文就细菌生物膜的一般特征与检测方法及其IBD中的作用作一综述。

一、细菌生物膜概述

1. 一般特征：肠道中细菌以浮游或生物膜两种方式生长。细菌附着于生物或非生物表面，产生胞外聚合物(extra-cellular polymeric substance, EPS)包裹菌落形成生物膜。生物膜成熟后会播散部分细菌至其他地方，形成新的生物膜，造成感染范围的扩大。有研究指出，脂肪酸、氧气、一氧化氮、铁、蛋白酶等均可有效诱导生物膜播散，然而生物膜在肠道中的具体播散机制有待进一步研究[2]。

生物膜形成后，不同菌群可在基质内互相影响，彼此进行营养交换和信息交流。同时，基质相当于为细菌提供了一层保护屏障，生物膜内部的细菌对外界压力有显著的抵抗力，造成顽固性感染。近年研究证明，生物膜与许多肠道疾病如IBD、结肠癌、家族性腺瘤性息肉病等相关[3]。

2. 形成步骤：生物膜的形成是一个动态的过程，主要包括5个步骤：①形成生物膜的表面吸附细菌赖以附着的有机或无机营养物质，形成调节膜，调节膜是覆盖在表面由体液形成的2～10 nm厚的蛋白吸附层，其表面蛋白、糖蛋白可作为特异性受体选择性与细菌黏附。②细菌可逆性附着。③细菌产生的EPS与黏附表面牢固结合，发展为不可逆性黏附。④细菌繁殖，黏附细菌分裂增殖形成的微小菌落是生物膜的基本组成单位。⑤成熟的生物膜可播散细菌至其他地方形成新的生物膜[4]。

3. 主要成分：在大多数细菌生物膜中，微生物占生物膜的10%以下，而EPS占90%以上。EPS与许多功能相关，包括黏附与聚集、保持生物膜水分和酶的活性、充当保护屏障、吸附有机物和无机离子、作为营养物质来源、基因信息的交流等[5]。

IBD肠道微生态失调主要表现为细菌多样性减少以及肠杆菌科细菌的增多，包括黏附性大肠埃希菌和侵袭性大肠埃希菌(AIEC)[6]。肠杆菌科细菌生物膜基质中主要包含卷曲纤维、纤维素、1型菌毛、鞭毛蛋白、胞外DNA等，其中卷曲纤维占85%以上，是基质的重要组成部分。

二、生物膜的检测方法

扫描电镜和荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization， FISH)是目前检测生物膜的金标准。FISH利用荧光标记的特异性DNA探针与样本DNA杂交之后染色成像，在量化细菌数量的同时可视化观察生物膜的立体结构，可定性、定量和相对定位分析DNA。

激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)结合荧光染料是原位观察黏膜中生物膜的重要工具[7]。与普通荧光显微镜相比，CLSM可对细胞内精细结构进行断层扫描，具有更高的空间分辨率和图像对比度，可形成清晰的三维图像。一项体外实验发现CLSM下可见生物膜具有多种多样化的结构，内部含有许多通道供细菌间进行营养交换和信息交流[8]。

三、生物膜与IBD的相关性

人体整个胃肠道均可形成生物膜，黏液丰富的区域微生物密度最高。肠道细菌利用凝胶状黏液作为基质发展成生物膜结构，同时黏液层也可作为附着于体内的媒介[9]。肠上皮细胞分泌黏蛋白，构成黏液屏障，避免了微生物与肠上皮细胞的直接接触。正常远端结肠内层黏液层致密且无菌，紧密黏附于上皮细胞；而外层的疏松黏液层包含大量细菌，但多是无害的共生菌群，不具侵入性[10]。共生菌形成的生物膜可增强与宿主的相互作用，有利于肠道稳态[11]。

在IBD的发生、发展中，特异性黏膜生物膜通过多种途径引起宿主肠道炎症反应。致病菌可穿透黏液层，直接与肠上皮细胞接触，与宿主的免疫和神经内分泌系统相互作用，发展成慢性黏膜炎症[1,12]。与健康个体相比，IBD患者活检标本中黏膜附着的生物膜检出率明显增高，且体外培养可形成更大的生物膜。Swidsinski等[13]的研究证实IBD患者肠道黏膜菌群的组成和空间结构均发生了改变。其中脆弱拟杆菌占80%以上，为IBD的特征菌群。

1. 细菌生物膜的直接促炎作用：肠道是人体微生物定植量最高的器官，其中含有丰富的革兰阴性杆菌，如肠杆菌属和沙门菌属等。在肠杆菌科的生物膜中，主要成分包括卷曲纤维、纤维素、1型菌毛、胞外DNA等。这些基质中的成分可与肠黏膜免疫系统相互作用，诱导IBD的发生。巨噬细胞是肠道固有免疫的重要组成部分，通过模式识别受体识别致病菌合成的保守分子模式，包括细菌胞外结构(如菌毛、鞭毛、脂多糖和肽聚糖)、卷曲纤维、1型菌毛等，可消灭潜在的致病菌。此外，微生物产物的模式识别受体参与激活信号转导通路，促进吞噬作用和炎症介质的产生[14]。

①卷曲纤维：卷曲纤维是由肠杆菌科的共生菌和致病菌分泌至生物膜胞外基质中的一种淀粉样蛋白，可抵抗蛋白酶的消化作用，增强生物膜抵抗外界恶劣环境的能力。大肠埃希菌分泌卷曲纤维主要由操纵子基因csg(curli subunit genes)编码和转录，而卷曲纤维的主要成分通过细菌分泌的csgA蛋白亚基自组装而成。Bian等[15]的研究使用不同大肠埃希菌菌株感染人体巨噬细胞，发现表达csgA蛋白的菌株诱导巨噬细胞产生的炎症因子水平均高于不表达csgA蛋白的菌株，证实csgA蛋白可刺激炎症因子的分泌。此外，体外实验证实大肠埃希菌在卷曲纤维表达缺失时并不能发育为成熟的生物膜，可见卷曲纤维与生物膜的成熟和播散相关[16]。

大量研究认为淀粉样蛋白可促进神经退行性疾病的发展，并且作为损伤相关的分子模式(DAMPs)与小胶质细胞表达的Toll样受体(TLRs)相互作用[17]，而细菌分泌的淀粉样蛋白有可能调节宿主与微生物的相互作用。卷曲纤维作为TLRs异源二聚体TLR1/2的配体可刺激多种细胞类型的免疫反应[5,18]。NOD样受体(NLRP3)可激活NLRP3炎症小体，诱导caspase-1的激活和白细胞介素1β(IL-1β)的成熟[19]。Th17细胞是组织炎症的有效诱导剂，与许多实验性自身免疫病的发病相关。分泌卷曲纤维的沙门菌以TLR2依赖的方式增强了Th17的免疫反应，TLR2的激活进一步诱导了IL-17A和IL-22相关的炎性反应[20]。此外，卷曲纤维可结合补体C1q，保护大肠埃希菌免受补体介导的吞噬作用，说明卷曲纤维有助于细菌的免疫逃逸，从而提高细菌的毒性[21]。值得注意的是，共生菌和致病菌表达的卷曲纤维是同源的，卷曲纤维并不作为单独的毒力因子而起作用。Oppong等[22]研究发现，口服卷曲纤维可改善TNBS诱导的小鼠肠炎，且与抗TNF-α治疗组结果无明显差异。上皮细胞可对卷曲纤维产生反应，导致屏障功能的加强以及移位细菌的减少。目前关于肠道对卷曲纤维免疫反应的研究结果差异较大，需未来进一步研究明确具体机制。

②纤维素：细菌合成纤维素与其产生卷曲纤维相关。研究证实纤维素的合成是生物膜形成的主要原因，且纤维素可增强AIEC的促炎能力[14,23]。Monteiro等[24]的研究表明，当大肠埃希菌Nissle 1917缺乏纤维素时并不能黏附于上皮细胞，说明纤维素是其形成生物膜所必需的，但该研究使用的是特定的菌株，实验结果不一定适用于其他菌株。Ellermann等[14]的研究进一步指出，细菌性纤维素可加剧AIEC诱导的IL-10-/-小鼠肠炎，并诱导Th17黏膜免疫反应，但确切的作用机制并不清楚，只能说明纤维素以一种间接机制调节宿主黏膜免疫反应，具体调控机制有待未来进一步阐明。肠道细菌性纤维素与膳食来源的纤维素难以区分，因此导致目前肠道细菌性纤维素的研究并不广泛。

③ 1型菌毛：肠杆菌科的1型菌毛可介导细菌附着，有助于生物膜的形成[25-26]。1型菌毛由FimA亚基组成，菌毛末端的FimH黏附素可与宿主细胞直接相互作用。此外，FimH通过TLR4激活先天免疫系统，促进炎症因子表达和中性粒细胞迁移[27]。肠上皮细胞顶端表达的癌胚抗原相关细胞黏附分子6(CEACAM6)即为一种1型菌毛受体[28]，Denizot等[29]的研究发现，与野生型小鼠相比，感染AIEC的CEABAC10小鼠出现肠道屏障功能障碍，表现为更严重的结肠炎。而阻断CEACAM6表达或感染AIEC的突变菌株(FimH缺陷)后，炎症减轻。由此可见，CEACAM6高表达促进了AIEC以FimH依赖的方式进行定植，从而进一步介导炎症的发生。

2. 细菌生物膜的间接促炎作用：肠黏膜细菌除直接促炎作用，还可通过产生基因毒素参与炎症的发生，其中以脆弱拟杆菌肠毒素(Bacteroidesfragilisenterotoxin, BFT)与IBD和结直肠癌的相关性较为清楚。当产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)定植于肠黏膜时，可通过激活STAT3和Th17免疫应答多种途径促进结肠炎的发展[30-32]。此外，BFT可刺激T84等结肠细胞株中精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)表达持续增高，造成细胞内活性氧含量升高和NLRP3炎症小体的激活，这一过程与IBD的发生密切相关[33]。

BFT还可增加肠上皮细胞的通透性，使致病菌与肠上皮细胞直接接触而诱发炎症，而反复炎症是IBD相关结直肠癌发生的基础。有研究[34]发现，在生物膜覆盖的肠黏膜中E-cadherin表达下调，肠上皮通透性增加，肠腔内抗原、内毒素等进入固有层诱发炎症反应，而低水平E-cadherin会进一步导致下游炎症性疾病和肿瘤相关通路的激活。由此可见，黏膜细菌可通过改变上皮细胞的通透性参与IBD相关结直肠癌的发生。

四、抗生物膜治疗

生物膜是肠道细菌一种自然的生活方式，其本身并不一定是疾病的标志。对于生物膜的研究应重点关注其在疾病中的行为特征，如远端结肠的生物膜虽然不能代表疾病的发生，但当黏附于上皮细胞的生物膜增多时应引起关注。在某些特定条件下，生物膜不需要被破坏，而部分黏附于上皮细胞的生物膜则需要被根除。越来越多的证据表明，细菌生物膜可改变肠上皮通透性，诱发持续的炎症反应。因此推测在肠道菌群诱发IBD的过程中，生物膜的形成与疾病的发生、发展息息相关。防止生物膜的过度生长以及破坏已建立的生物膜至关重要，抗生物膜治疗可能是未来治疗IBD的一个新方向。目前抗生物膜策略主要包括阻止细菌黏附、防止生物膜的形成、直接杀灭细菌、破坏EPS的结构和功能等。

1. 细菌生物膜的常规治疗：抗菌药物是目前细菌感染的首选治疗方法，但并不能完全根除生物膜。这是由于包裹在基质中的细菌大部分处于“休眠”状态，整体代谢水平下降，同时EPS中高金属离子浓度和低pH值使抗菌药物失活，导致细菌对抗菌药物的敏感性下降。低剂量抗菌药物会激活生物膜内的细菌，促使其向外界播散，而大量证据又表明过多使用抗菌药物会导致一系列不良反应，如宿主菌群失调、机会致病菌感染风险增加、细菌耐药等。值得一提的是，生物膜细菌对抗菌药物的耐药性较浮游细胞高出1 000倍。除受上述生物膜特性影响外，生物膜耐药性与其膜内细菌群体感应系统相关，生物膜中无数细胞通过群体感应彼此以建立通信来共享信息细菌，促进病原菌对抗菌药物耐药性的增加。因此，群体感应系统抑制剂被认为是抗生物膜治疗的新策略，可有效减少细菌毒力，提高抗菌疗效。然而，目前群体感应系统调控生物膜的具体机制尚不明确，且许多抑制剂具有细胞毒性，其安全性有待未来进一步研究[35]。

2. 肠道生物膜的治疗：EPS构成了细菌的直接生活环境，致密结构使抗菌药物难以渗透至菌膜内部的细菌，大大降低了抗菌药物的杀菌作用。因此，靶向EPS将成为瓦解细菌生物膜的有效方法[36]。

①促进EPS解离：基质中含有金属阳离子(如钙、铁、镁)等，参与维持基质的稳定性，构成了生物膜紧密连接的三维结构支架。金属离子的螯合剂除干扰细菌生物膜的稳定性外，还可破坏已形成的生物膜。IBD患者肠黏膜细菌培养形成的生物膜更大、细胞更多，且胞内铁浓度含量更高，而普遍观点认为膳食补铁会导致IBD疾病恶化和感染风险升高，推测可能是由于改变了共生菌群以及增加了肠杆菌丰度[37-38]。既往观点认为硫化氢是黏膜防御的重要介质，可影响黏膜血流量、调节碳酸氢盐和黏液的分泌[39]。有实验证实，硫化氢还可减少微生物铁的摄入量以降低IBD相关生物膜的毒性，并重建黏液屏障，这一发现为未来靶向宿主炎症与微生物失调提供了新的思路[40]。

②益生菌竞争性抑制：益生菌菌株可在肠黏膜表面形成非致病性生物膜，故可阻断病原菌的黏附。大量动物实验和临床研究证实，益生菌可有效诱导IBD患者病情缓解。停止服用益生菌后，粪便中脱落的益生菌菌株急剧减少，推测是由于结肠多种细菌的混合菌膜通常不易渗透新的细菌，因此益生菌疗效取决于具体的菌种组成及其自身性质[41]。此外，有证据表明益生菌会干扰抗菌药物治疗后自身菌群的重建，因此未来需制定更个性化的益生菌治疗方案以减少对宿主菌群稳态的不良效应[42]。

③药物递送系统：纳米递药系统近来受到广泛关注，因其具有良好的生物相容性、持续的稳定性、较高的载药量和包封率，可保证足量的药物递送至病变部位[43]。目前实验或临床中应用的纳米递药系统主要包括脂质体、无极材料粒子、胶束、聚合物纳米粒子等。纳米递药系统具有减少近端肠道药物损失、提高局部药物浓度等特点，在溃疡性结肠炎的治疗中具有广阔的前景。Tian等[44]的研究制备了由聚乙二醇-b-聚己内酯(PEG-b-PCL)和聚己内酯-b-聚四氨酯(PCL-b-PQAE)共组装的一种双功能胶束，并修饰两性离子(含羟基的pH敏感羧基甜菜碱衍生物)。这种新型胶束不仅可靶向生物膜，而且两性离子基团可与胞外DNA、蛋白等相互作用，瓦解生物膜的完整性，提高抗菌效能。目前纳米递药系统尚未大规模投入临床应用，随着后续研究的深入，相信未来可发挥更大的作用。

五、展望

关于肠道菌群在IBD中的发病机制，大部分传统研究限于菌种的组成和丰度，而未涉及菌群的空间结构。评估菌群与黏膜的位置关系有助于了解宿主与微生物群落间的相互作用，并指导未来IBD联合治疗的发展。目前IBD的药物治疗存在一定的局限性，寻找新的治疗药物刻不容缓，抗生物膜治疗提供了一种新的选择。然而生物膜同时参与肠道稳态的构建，未来需研究出更具特异性的生物膜清除方法。此外，生物膜究竟是疾病的病因还是结果，是疾病的标志还是可以干预治疗的潜在靶点，均需行进一步探索。