大黄素对白内障大鼠晶状体氧化应激和炎症影响的机制研究

赵勇洁 尚利晓 李 琰

糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，其特点是胰岛素分泌减少或作用缺陷导致的高血糖。长期高血糖与许多胰岛素依赖性器官如视网膜、晶状体、神经元和肾脏的并发症相关[1]。根据国际糖尿病联合会预计，到2030年，全世界将有4.39亿人患有糖尿病。而糖尿病患者同时患有白内障的概率是正常人的2.5倍，且年龄越小，患白内障的概率就越大[2]。白内障是糖尿病患者暴露在不受控制的慢性高血糖状态下最常见的并发症之一，它的特征是眼晶状体浑浊，进一步可能导致失明[3]。由于糖尿病在许多国家的高发生率，糖尿病性白内障成为了失明的一个主要问题。

大黄素是一种天然蒽醌衍生物，是一种从植物中分离出来的中草药的活性成分。研究发现大黄素具有广泛的药理特性，包括抗癌、保护肝脏、抗炎、抗氧化和抗菌活性[4，5]。此外，大黄素还被认为可以通过靶向胰岛素抵抗来改善葡萄糖代谢，用于治疗糖尿病[6]。同时对于糖尿病的许多并发症也有改善作用，包括糖尿病性心肌病和糖尿病肾病等[7，8]。然而，其对糖尿病性白内障的影响尚不清楚。

本研究旨在对大黄素对糖尿病性白内障大鼠的治疗效果和对晶状体的氧化应激和炎症水平进行探讨，进一步研究其可能的分子机制，为临床治疗糖尿病性白内障提供理论基础和治疗靶点。

材料与方法

1.材料：50只成年雄性Sprague-Dawley大鼠体质量约150～220g，动物被饲养在温度(22～25℃)和湿度(25%～35%)恒定的环境中，12h明暗交替光照周期，可获得足够的纯净水和标准鼠粮，该动物护理方案得到了笔者医院医学伦理学委员会的批准。STZ购自美国Sigma公司，使用前溶于20mmol/L柠檬酸钠缓冲液中，pH 4.5(10mg STZ/ml柠檬酸缓冲液)，溶液通过0.22μm微孔过滤器过滤，放入已灭菌的容器中，置于冰上，溶解后10min内使用。大黄素和水合氯醛溶液均购自美国Sigma-Aldrich公司。SOD、MDA、IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，Keap1、Nrf2和Actin抗体均购自英国Abcam公司。

2.糖尿病性白内障大鼠模型的建立及药物干预：将50只SD大鼠随机分为对照组、模型组、大黄素低、中、高剂量组(n=10)。禁食过夜，后4组大鼠绕开肠道腹腔一次性注射STZ(65mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，对照组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。48h后，从尾静脉采血，使用Accu Chek Performa血糖仪测定血糖水平。血糖值>16.7mol/L者为造模成功。造模成功后，立即给予大黄素低(30mg/kg)、中(60mg/kg)、高(90mg/kg)剂量组大鼠大黄素灌胃，对照组与模型组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次，连续给药8周。

3.评估大鼠体质量和血糖：在大黄素灌胃治疗的8周内，每周进行各组大鼠的体质量和血糖评估，从尾血样采血测定空腹血糖水平。治疗8周后，所有大鼠均采用麻醉过量安乐死，摘除眼睛，切除和摘取完整的晶状体，-80℃保存，直到进一步实验。

4.裂隙灯检查及白内障分级：裂隙灯检查每周进行1次。使用10%水合氯醛麻醉，局部托品卡胺和盐酸苯肾上腺素扩张瞳孔，然后用裂隙灯显微镜检查眼睛。晶状体混浊的进展准确地可分为5个阶段，如之前的文献所述：阶段0，正常晶状体；阶段1，透镜中心的最小不透明度；阶段2，晶状体中心和周围出现不透明斑片状；阶段3，晶状体全部均匀乳光；阶段4，核性白内障伴有晶状体混浊[9]。

5.测定大鼠晶状体中氧化应激与炎症水平：每只大鼠的晶状体均用1ml 50mmol/L的冷磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4)匀浆。匀浆890g离心15min，分离上清，用于生化指标的测定。通过测定晶状体组织中SOD活性和MDA浓度，测定晶状体氧化应激。通过测定晶状体中IL-1β和 TNF-α水平，评估晶状体炎症水平。对于所有氧化应激和炎症参数，使用了ELISA试剂盒，样品一式3份进行检测，所有的评估都是重复进行的。

6.Western blot法检测：所有晶状体在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中研磨，匀浆，然后在Eppendorf管中离心。采用透明上清液进行蛋白测定，蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。所提蛋白质经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电印迹在硝基纤维素膜上，并检测Keap1和Nrf2抗体，以Actin为内参。使用Image J软件对蛋白条带进行量化，并归一化到相应的对照组。

结 果

1.大黄素对糖尿病性白内障大鼠体质量和血糖的影响：在5组大鼠中，体质量均以双向方式增加。在实验期间，与对照组比较，STZ组大鼠的体质量增加较为缓慢，与STZ组比较，大黄素治疗组大鼠的体质量增加有所升高，直到8周龄(图1A)。同时，与对照组比较，STZ组大鼠血糖从1～8周显著升高，而与STZ组比较，大黄素治疗组大鼠的血糖水平明显降低(图1B)。

图1 大鼠体质量和血糖变化A.体质量变化；B.血糖水平变化

2.大黄素对糖尿病性白内障大鼠晶状体浑浊的影响：所有患有糖尿病的大鼠都以相同的速率或多或少地患上白内障。在注射STZ后的第4周，晶状体才开始变得不透明。对照组大鼠的晶状体始终保持透明，STZ组大鼠晶状体浑浊，已达到阶段4，而经大黄素治疗8周后，大鼠晶状体浑浊程度有所降低，抑制了糖尿病大鼠白内障发展为阶段4的速度，且高剂量的大黄素表现出最佳治疗效果(图2)。

3.大黄素对糖尿病性白内障大鼠晶状体氧化应激和炎症水平的影响：ELISA实验结果表明，大黄素治疗8周后，与对照组比较，STZ组大鼠晶状体组织中SOD活性降低，MDA浓度升高；与STZ组比较，大黄素各治疗组SOD活性升高(图3A)，MDA水平显著降低(图3B)。同时，测定晶状体中炎性因子IL-1β和 TNF-α水平发现，与对照组比较，STZ组大鼠晶状体组织中IL-1β和 TNF-α水平升高；与STZ组比较，大黄素各治疗组IL-1β(图3C)和 TNF-α(图3D)水平降低。其中，大黄素高剂量组变化最显著。

图3 大鼠晶状体中氧化应激和炎症水平变化A. SOD活性；B. MDA浓度；C. IL-1β水平；D.TNF-α水平；与对照组比较，*P<0.01；与STZ组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

4.大黄素对Keap1和Nrf2蛋白水平的影响：Western blot法检测结果表明，大黄素治疗8周后，与对照组比较，STZ组大鼠晶状体组织中Keap1蛋白表达升高，Nrf2蛋白表达降低；而与STZ组比较，大黄素各治疗组Keap1蛋白表达降低，Nrf2蛋白表达升高，呈现出一定的剂量依赖性(图4)。

图4 大鼠晶状体中Keap1和Nrf2蛋白水平变化

讨 论

糖尿病是一种代谢性疾病，其特征是由于胰岛素生产或作用的绝对或相对不足而导致高血糖，引起慢性高血糖、脂质、碳水化合物紊乱、视网膜、肾小球和周围神经微血管病等疾病。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经系统的慢性损害和功能障碍[10]。在眼睛方面，糖尿病与白内障或晶状体混浊的高发生率有关[11]。到目前为止，白内障仍然是世界上致盲的主要原因。因此，研究治疗糖尿病性白内障的药物及其可能的作用机制显得极其重要。

大黄素是从掌叶大黄根茎中提取的天然活性蒽醌类化合物，是许多泻药和中草药的活性成分[12]。大黄素被发现具有多种生物学功能，包括抗炎症、抗癌、利尿、血管松弛、免疫抑制和抗病毒特性[13，14]。此外，大黄素还具有公认的抗糖尿病的潜力，恶化啮齿动物葡萄糖耐受性，通过抑制发挥抗炎作用的NF-κB通路对糖尿病有治疗作用[15，16]。而糖尿病性白内障是糖尿病的并发症之一，大黄素对其是否具有功能还尚不清楚。为此，笔者构建了糖尿病大鼠模型，并通过8周大黄素低、中、高剂量的灌胃治疗，发现大黄素可显著降低糖尿病性白内障大鼠体质量和血糖的升高，可抑制糖尿病性白内障大鼠晶状体浑浊，ELISA结果显示，大黄素可升高糖尿病性白内障大鼠晶状体中SOD活性，降低MDA浓度，还可降低晶状体中炎性因子IL-1β和TNF-α水平。因此，大黄素可减轻糖尿病性白内障大鼠晶状体的氧化应激和炎症水平。

为了进一步探讨其可能的作用机制，笔者检测了各组大鼠晶状体内Keap1和Nrf2的表达。Keap1-Nrf2系统被认为是对抗氧化应激的主要细胞防御机制之一[17]。Nrf2是一种重要的核转录诱导物，作为Nrf2介导的抗氧化系统的分子开关，它与DNA启动子中的抗氧化反应元件结合，控制许多抗氧化基因的转录[18]。Keap1作为氧化应激传感器和Nrf2主要抑制剂，能与Nrf2发生蛋白相互作用，共同调控氧化应激过程[19]。Western blot法检测结果显示，大黄素下调糖尿病性白内障大鼠晶状体中Keap1蛋白水平，上调Nrf2蛋白水平，即激活Nrf2抗氧化通路。因此，提示大黄素可能通过抑制Keap1激活Nrf2抗氧化通路，进而改善糖尿病性白内障大鼠晶状体浑浊。

综上所述，大黄素可能通过调控keap1-Nrf2通路，提高糖尿病大鼠晶状体抗氧化能力，减轻糖尿病性白内障大鼠晶状体氧化应激和炎症水平，以此对STZ诱导的糖尿病性白内障大鼠的晶状体浑浊具有一定的抑制作用，并且大黄素的抑制作用呈现一定的浓度依赖性。