主动脉瓣钙化患者基因表达与microRNA调控研究

邵晗琪 刘玉琴

主动脉瓣钙化(calcific aortic valve disease, CAVD)是最常见的老年人的瓣膜性心脏病，在中国的发生率不断增加[1]。CAVD患者通常会出现胸闷、疼痛、呼吸困难和晕厥，可能导致充血性心力衰竭和心源性猝死[2]。目前，CAVD唯一可治愈的方法是侵入性治疗，包括外科主动脉瓣置换术和经导管主动脉瓣植入术[3,4]。然而，这种治疗措施存在一定的局限性，如主动脉的血流动力学不能完全恢复，主动脉窦的解剖学结构不能完全重建，且生物人工瓣膜仍然有钙化和成骨的风险。另外，即使成功的侵入性治疗也可能导致严重的心脑血管不良事件，并产生更多的创伤和医疗费用[5]。因此，对CAVD进行早期诊断并提供有效的药物治疗仍是巨大的挑战。

miRNA通过RNA诱导沉默复合体导致mRNA的降解和翻译的抑制，因此miRNA失调可能参与CAVD发生。有研究表明，miRNA参与CAVD的调控过程，如miR-92a可作为急性CAVD的潜在分子标志物，miR-34a可通过抑制Notch1-Runx2信号通路缓解CAVD[6,7]。然而，目前通过多组学的手段对CAVD患者样本进行联合分析的研究较少。

因此，本研究在GEO数据库上收集了CAVD相关的基因表达及miRNA芯片数据，采用更严格的统计分析方法筛选差异基因与miRNA，并进行了miRNA-差异基因的生物信息学联合分析，同时检索了不同病因相关基因的差异表达情况，旨在寻找潜在药物干预靶点，为探究有效的治疗方式提供新思路。

资料与方法

1. 数据收集：以“calcific aortic valve”、“Homo sapiens”为关键词，在GEO数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)找到2组转录组测序数据(GSE55492、GSE76718)、1组基因芯片数据(GSE51472)及1组miRNA芯片数据(GSE87885)。GSE55492与GSE76718分别包括10例健康人及9例CAVD患者、8例健康人及9例CAVD患者的主动脉瓣样本。GSE51472包括5例健康人及5例CAVD患者的主动脉瓣样本。GSE87885包括3例健康人及2例CAVD患者的主动脉瓣样本。研究的分析流程详见图1。

图1 研究分析流程图

2.基因差异表达分析：对于转录组测序数据，使用软件Bowtie2(2.1.0)和HISAT2(2.1.0)将RNA-Seq读序与人类基因组数据库(UCSC hg19)进行比对，并使用HTSeq(0.11.2)进行基因注释并统计每个基因的读序数，最后通过R语言中的DESeq2程序包对差异基因进行统计分析。对于基因芯片数据，利用R语言中GEOquery程序包获得基因表达矩阵，并使用limma分析获得差异基因。定义每个数据集中利用Benjamini-Hochberg(B-H)法校正后的P<0.05，且|log2(变化倍数)|>1的基因为差异基因，并对2个及以上的数据集中的差异基因进行后续分析。

3.主成分分析(principal component analysis，PCA)：利用R中的mixOmics包，对3个数据集中的差异基因进行多变量分析并进行可视化展示。

4.差异基因聚类：利用MetaCore数据库(Clarivate Analytics, https:∥portal.genego.com/)对差异基因进行聚类分析，并定义错误发现率(false discovery rate, FDR)<0.05的生物学过程/通路为显著性富集。利用Cytoscape的Enrichment map对排名前300的生物学过程进行了可视化分析。

5.miRNA差异表达分析：3例健康者miRNA丰度的平均值作为对照，利用R中的DEGSeq包分别将2例患者的miRNA丰度与对照比较，并定义B-H法校正后的P<0.1的miRNA为差异表达的miRNA，随后对2例患者的差异miRNA取交集。

6.miRNA与差异基因调控网络：在miRTarBase网站(http:∥mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)上检索miRNA与基因的靶向关系，利用Cytoscape对miRNA-基因调控网络进行可视化分析。

结 果

1. 差异基因筛选及PCA分析：研究分析了3个基因表达数据集中，CAVD与健康组比较显著差异表达的基因(图2A～C)，并用PCA进行降维分析，以比较CAVD与健康组之间基因表达的差异，3个数据集中，CAVD组与健康组之间差异明显(图2D～F)。

2.差异基因聚类：为进一步探寻差异基因的功能，研究进行了Gene Ontology的生物学过程与分子通路聚类分析。从生物学过程网络中可以看出，上下调基因均可集中在对外界刺激的反应上(图3A和B)，另外，上调基因还集中于生物高分子代谢、免疫细胞激活(图3A)，而下调基因集中于心肌细胞发育及离子稳态(图3B)。分子通路聚类显示，上调基因(表1)可聚类到类风湿关节炎、前列腺癌骨转移、T细胞共信号受体、肿瘤浸润B细胞在抗肿瘤免疫中的作用以及肥胖、2型糖尿病和X型代谢综合征的脂肪组织和肝脏炎症中的趋化因子通路，下调基因(表2)可聚类到褐色脂肪细胞分化中的β肾上腺素能受体、环-AMP介导的β肾上腺素能受体信号、心肌肥厚中的NF-AT信号、心肌细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性调节及AVP在调节水通道蛋白2和肾脏水重吸收中的作用通路，其中β肾上腺素能受体通路为β1肾上腺素能受体(ADRA2C)相关通路。值得注意的是，多个MHC Ⅱ类分子相关基因(HLA-DOB、HLA-DRA、HLA-DQB1、HLA-DRB1、HLA-DRB5)表达升高，与之前研究相一致。而肌腱蛋白相关基因(TNN、TNNC1)、肌钙蛋白(TNNT2)及肌球蛋白(MYH7、MYH11、MYH14)表达降低。

表1 上调基因聚类的分子通路

3. miRNA-差异基因调控网络：通过对3例健康人和2例CAVD患者的miRNA芯片进行差异分析，得到了87条下调和23条上调的miRNA。研究分析了miRNA与表1及表2中显著富集基因的相互作用,并分为下调miRNA-上调基因与上调miRNA-下调基因两种相互作用模式(图4)。在下调miRNA-上调基因模式中，HLA-DRB1和HLA-DRB5可被3个miRNA (hsa-miR-1250-3p、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-211-5p)调控，而VCAM1可被5个miRNA (hsa-miR-4677-5p、hsa-miR-506-5p、hsa-miR-548ah-3p、hsa-miR-6511a-5p、hsa-miR-4683)调控。在上调miRNA-下调基因模式中，HAND2与hsa-miR-6081、ACTC1与hsa-miR-4793-5p存在相互作用。

表2 下调基因聚类的分子通路

图4 CAVD miRNA与靶基因相互作用网络图

4.CAVD相关原因分析：为探究不同病因引起CAVD之间的联系，检索了多种病因相关基因的变化，发现与计算出的DEGs存在交集(表3)。

表3 CAVD病因的相关基因变化[8～11]

讨 论

关于CAVD的研究存在一定局限性，如单个数据集的样本量小、整合多个数据集时方法不正确以及缺少miRNA-mRNA的相关性研究。本研究在GEO数据库上挖掘了CAVD相关的基因表达及miRNA芯片数据。由于基因表达不同平台、不同批次之间存在差异，笔者采用在不同数据集中分别计算差异基因并取交集的方式，找到了475个上调基因和400个下调基因，以及87条下调的miRNA和23条上调的miRNA。

通过对差异基因进行聚类分析，笔者发现在CAVD患者中，细胞对外界刺激的应答发生紊乱，而与生物高分子代谢及免疫应答过程相关的基因显著上调，与心肌细胞发育及离子稳态相关的基因显著下调。分子通路的聚类结果与生物学过程一致，上调基因聚类排名前5的通路均与免疫过程有关，5个MHC Ⅱ类分子相关基因(HLA-DOB、HLA-DRA、HLA-DQB1、HLA-DRB1、HLA-DRB5)参与了其中4个分子通路。先前的研究表明，CAVD的发生与发展过程中会出现炎性反应，而T细胞与巨噬细胞则参与了早期的主动脉损伤[12～14]。这证明了本研究分析的准确性。另外在CAVD患者中，β1肾上腺素能受体通路及NF-AT、eNOS信号通路相关基因表达下降，其中，β1肾上腺素能受体通路对心肌功能产生正性作用，可使心脏射血速度加快、心率上升，其表达下调可能是CAVD患者心脏功能受损的原因之一。NF-AT信号通路功能的损伤可能对CAVD的疾病进程起正性作用[15]。eNOS已被证明是CAVD的分子标志物[16]。在eNOS信号通路中，eNOS上游的抑制基因CAV3的下调，是导致eNOS水平上升的原因之一。另外，肌腱蛋白、肌钙蛋白及肌球蛋白基因均发生显著下调，其中肌腱蛋白是一种在胚胎形成和器官发育过程中高度表达的细胞外基质糖蛋白，而肌钙蛋白和肌球蛋白都参与心肌细胞的收缩过程，这些关键基因的下调可能是CAVD的致病机制之一。

为探究CAVD中miRNA与基因表达之间的关系，笔者在miRTarBase上查找了差异miRNA与差异基因的靶向关系，分为下调miRNA-上调基因与上调miRNA-下调基因两种相互作用模式。在下调miRNA-上调基因作用模式中，hsa-miR-1250-3p、hsa-miR-141-5p及hsa-miR-211-5p可以靶向HLA-DRB1和HLA-DRB5，这3条miRNA表达量的降低可能是两种MHC Ⅱ类分子表达量升高的原因之一。而VCAM1可同时被hsa-miR-4677-5p、hsa-miR-506-5p、hsa-miR-548ah-3p、hsa-miR-6511a-5p及hsa-miR-4683靶向调控。研究表明，VCAM1高表达会导致主动脉瓣上皮细胞的钙化，并参与白细胞的趋附[17,18]。这5条miRNA表达的紊乱可能促进CAVD的发生。在上调miRNA-下调基因作用模式中，hsa-miR-6081可靶向HAND2，先前研究表明，HAND2功能损伤会导致先天性心脏缺陷[19]。另外，hsa-miR-4793-5p可靶向ACTC1，ACTC1表达降低可能通过诱导心肌细胞凋亡导致先天性心脏病[20]。目前尚无研究表明这些miRNA的变化与CAVD的关系，通过有效手段干预miRNA的作用或表达，可能是预防及治疗CAVD的有效措施之一。

CAVD病因复杂，常见病因有主动脉瓣狭窄、风湿性瓣膜病、二瓣畸形以及动脉粥样硬化等。研究从差异基因的角度分析了不同病因引起CAVD的联系，发现多种病因的相关基因均发生了显著变化。因此，对于不同病因引起的CAVD，都有可能通过干预差异基因或差异miRNA的方式改善患者的临床症状，这需要进一步的实验研究。

综上所述，本研究采用更严格的统计学分析方法，阐释了CAVD的基因表达谱及miRNA表达谱，找到了关键的生物学过程、分子通路及相关基因，并进一步阐明了miRNA-基因表达的相互作用网络。本研究利用生物信息学的方法，为CAVD的分子机制提供了补充，并为干预和治疗方法提供了新的方向。未来还需要扩大患者的样本量，并进行进一步的实验验证。