高盐摄入对小鼠肠道GLP-1表达的影响

段碧晗 高 凌

随着2型糖尿病和高血压发生率的明显增加，伴有高血压的糖尿病患者罹患心血管疾病的风险增加了1倍[1]。而高盐摄入被认为是与生活方式有关的高血压和心血管疾病的重要危险因素[2]。在人群中减少盐的摄入被认为是预防糖尿病等非传染性疾病(non-communicable diseases，NCDs)的前5项干预措施之一[3]。为了减少NCDs，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)计划将盐摄入量减少30%，并将此计划作为九个全球目标之一[4]。目前高血压和糖尿病的发生率逐年上升，两种疾病都会导致严重的并发症，例如心血管疾病和慢性肾脏疾病等[5]。这会在很长一段时间内增加死亡风险，因此预防和延缓高血压、糖尿病的发生是医学面临的巨大挑战。

盐作为一种无热量的必需微量元素，最近发现它与糖尿病的发展有关。在一项纵向研究中发现，高盐摄入量可以独立预测糖尿病的发生[6]。胃肠道营养素触发的信号，如胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)在调节能量摄入中起重要作用。GLP-1主要是由肠道的L细胞中产生的肠源激素，通过增加胰岛素和抑制胰高血糖素分泌来控制膳食相关的血糖波动，同时还能抑制胃排空和食物摄入[7]。同时过量的盐摄入与心血管疾病相关，并认为是高血压发病的病因之一[8]。高盐饮食可通过不同途径促进高血压的发展[9, 10]。有趣的是，GLP-1也为心血管系统带来了好处。例如抑制高血压的发展，减少心脏纤维化和肥大[11]。有报道称，GLP-1可通过利尿和利钠作用降低血压，GLP-1受体的活化通过促进心钠素的分泌而降低血压[11]。而高盐饮食衰减GLP-1对血压的保护作用[12, 13]。目前关于肠道GLP-1表达水平与小鼠饮食盐摄入量之间关系的研究较少。本研究旨在观察高盐饮食后，小鼠糖脂代谢、血压及肠道GLP-1表达的变化。

材料与方法

1.实验动物与分组：20只8周大的C57BL/6雄性小鼠，SPF(specific pathogen free)级，由武汉大学人民医院动物实验中心提供。实验动物饲养在SPF级屏障环境中，适应性喂养1周后开始实验。称量实验动物体质量，依照数字表法随机分为两组，正常对照组:整个实验过程中用普通饲料喂养小鼠(n=10)；高盐组:小鼠接受特制高盐饲料(n=10)，每组小鼠均自由进食、饮水，接受同等的光照时长，实验持续时间为8周。

2.试剂与仪器：特制8%高盐饲料，高盐饲料为在普通饲料基础上每100g普通饲料添加 8g NaCl的8%高盐特制饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)，血糖仪与配套的血糖试纸(日本泰尔茂公司)，无创血压系统(CODA，美国Kent Scientific公司)，称量器(MP2001，上海舜宇恒平科学仪器公司)，分析天平(CP124S，德国赛多利斯公司)，正置显微镜(BX51，日本奥林巴斯公司)，生化自动分析仪(ADVIA2400，德国西门子公司)，病理切片机(RM2601，上海徕卡仪器有限公司)，4%甲醛固定液(武汉谷歌生物有限公司)，GLP-1抗体(武汉谷歌生物有限公司)，戊巴比妥钠(德国Merck公司)。

3.空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)测定: 于实验末，将实验小鼠禁食(不禁水)14h后，抓取并固定小鼠，将尾尖剪去约3mm，采血约0.05ml，按照血糖仪说明书步骤测定小鼠尾静脉快速血糖。

4.血压测量：实验8周后，使用标准无创尾部血测压系统测量小鼠尾动脉血压，保持小鼠安静状态，将袖带附在尾巴上，然后记录收缩压和舒张压，重复测量15次，取平均值为最终血压值。

5.血脂检测: 通过眼眶取血收集血液，离心后分离小鼠血清并保存至-80℃直至分析。血清甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(serum total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)使用全自动生化分析仪测量。

6.肠道(小肠上段) GLP-1检测: 小鼠予1%戊巴比妥钠麻醉(50mg/kg)，眼眶取血后处死，打开腹腔及胸腔，使用0.9%NaCl注射液对小鼠予以心脏灌流，待肾脏由红色变为灰白色即可，分离出小肠，分别做好标记后，将标本固定于4%多聚甲醛中48h，脱水后进行石蜡包埋，用于免疫组化实验。根据免疫组化实验步骤，检测小鼠肠道 GLP-1的表达，通过正置显微镜观察切片，采集图像后分析结果。

结 果

1.小鼠一般情况比较：实验前，高盐组和对照组小鼠毛发光滑润泽，反应灵敏。实验8周时，两组外观无明显差别。于实验第4周末及8周末时称量小鼠体质量，与对照组比较，高盐组小鼠的体质量增加差异无统计学意义(P>0.05)，两组小鼠体质量情况详见表1。

表1 两组小鼠体质量情况

2.小鼠血脂和FBG的比较：与正常对照组比较，实验末，在禁食(不禁水)状态下，8%高盐饮食8周后，高盐组FBG水平明显高于正常对照组(P<0.05)。高盐饮食组小鼠血清中TC、TG含量明显升高(P<0.05)，HDL-C含量明显降低(P<0.05)，两组小鼠血清中LDL-C含量比较，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

3.小鼠血压比较：与处理前比较，8%高盐饲料喂养8周后，高盐组收缩压、舒张压均显著增高，差异有统计学意义(表3)。

表3 小鼠实验前后血压比较

4.小鼠小肠上段GLP -1表达的变化：GLP-1的免疫反应性位于肠道黏膜的卵圆形或锥体上皮细胞的细胞质中，其形态与肠道内分泌细胞一致，小鼠小肠上段组织中GLP-1 阳性表达为胞质内淡黄色-棕黄色颗粒。与对照组比较，实验8周后，小鼠小肠上段免疫组化染色结果显示，高盐组小鼠小肠上段GLP-1阳性细胞数量明显少于对照组小鼠(P<0.05，图1)。对照组和高盐组小肠上段组织GLP-1阳性表达的平均累计吸光度分别为：对照组13.53±1.66，高盐组6.58±2.11，差异有统计学意义(P=0.011)。

图1 小鼠小肠上段组织GLP-1表达的变化(免疫组化染色，×200)A.高盐组；B.对照组;箭头指示阳性细胞

讨 论

每天适量的盐摄入对于维持细胞外液、血压、血管功能的稳态至关重要[14]。但现在越来越多的证据表明，高盐饮食与许多疾病之间存在联系。为了研究高盐饮食对小鼠糖脂代谢、血压及肠道GLP-1表达的影响，笔者分析了喂养高盐饮食8周的小鼠FBG、血清血脂水平、血压及肠道GLP-1表达情况。在这项研究中，尽管未观察到小鼠体质量的变化，但是，与对照组比较，8%高盐饲料喂养8周后，小鼠表现出空腹血糖受损、血脂异常、血压升高。另外，小鼠肠道GLP-1的表达也会减少。这些变化意味着高盐摄入会影响小鼠的健康。实验结果提示高盐饮食可引起小鼠空腹血糖、血清血脂高于对照组，同时升高血压。这可能与高盐饮食导致GLP-1表达减少有关。

本研究发现，8%高盐饮食8周后，小鼠血压水平与对照组比较升高。有研究表明血清活性GLP-1具有抗高血压作用。GLP-1受体在肾脏中表达，介导利尿和利钠作用[15]。研究表明，GLP-1对肾素-血管紧张素醛固酮具有抑制作用[16]。高盐饮食后，肠道GLP-1表达水平降低，从而减弱GLP-1对血压的保护作用。在一般人群中，空腹葡萄糖受损是一种常见的血糖异常，空腹葡萄糖受损被认为是糖尿病前期状态。在收缩压≥140mmHg时，空腹血糖受损会显著增加8年总病死率和心血管疾病病死率[17]。本研究发现，与对照组比较，高盐组小鼠实验8周后，FBG水平升高。GLP-1有利于降低血糖并使血糖维持在恒定水平。高盐饮食后，小鼠FBG升高可能与肠道GLP-1表达水平降低有关。血清TC水平的升高被证明是冠心病的危险因素。同时，TG水平升高与心血管事件发生率增加独立相关[18]。本研究发现高盐饮食使得血清TC、TG水平明显升高，这一结果提示高盐饮食与心血管疾病密切相关。

本研究检测了小鼠小肠GLP-1的表达。GLP-1是肠内分泌L细胞中产生的肠降血糖激素，并根据食物摄入而释放到血液中[19]。此前的研究已经提出，GLP-1可抑制胃排空，以抑制附加的食物摄取和餐后高血糖[20]。到目前为止，盐调节GLP-1的分子机制尚不明确，可能通过以下作用机制起作用,首先，钠葡萄糖同向共转运蛋白1(sodium glucose co-transporter 1，SGLT-1)抑制后可增强肠促胰素GLP-1 分泌[21, 22]。此外，本课题组前期研究发现，与正常饮食小鼠比较，高盐饮食后小鼠肠道SGLT-1表达增加[23]。可推断高盐干预会降低并延迟GLP-1的分泌。其次有文献报道，高盐摄入(含5% NaCl)可导致自主神经活动减弱。高盐摄入引起的自主神经活动减弱也可能导致GLP-1分泌减少。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)与葡萄糖触发的GLP-1释放有关，而醋酸脱氧皮质酮盐型高血压大鼠中KATP功能是受损的。因此笔者推断受损的KATP可能导致GLP-1释放减少。这些研究共同表明，高盐饮食可导致小鼠GLP-1的表达、分泌和释放减少。

综上所述，本研究表明高盐饮食会降低小鼠小肠GLP-1的表达，并升高小鼠的血压，影响小鼠的糖脂代谢，而小鼠的血压和糖脂代谢与GLP-1密切相关。笔者希望提供有关高盐摄入对心血管疾病、糖脂代谢影响的证据。高血压和糖尿病为慢性病的两大主要病种，在心血管疾病、糖尿病等慢性病防治中，应强调对盐摄入限制的重要性，减少钠盐的摄入，降低心血管疾病、糖尿病等疾病风险。