局部注射环孢素A对非肥胖糖尿病小鼠下颌下腺分泌功能及炎症的影响

朱忆颖，闵赛南，俞光岩

(北京大学口腔医学院·口腔医院，口腔颌面外科 国家口腔医学中心 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室, 北京 100081)

舍格伦综合征(Sjögren’s syndrome, SS)是一种全身慢性自身免疫性疾病，累及唾液腺后出现唾液分泌减少，导致口干及咀嚼、吞咽、语言等功能障碍，进而继发猖獗龋、口腔黏膜真菌感染等，严重影响患者生活质量。目前SS多采用人工唾液进行对症治疗，采用毛果芸香碱和西维美林等催唾剂促进唾液分泌[1]，病情较重者可采用免疫抑制剂[2]。整体而言，重症SS尚缺乏成熟、有效的治疗方法，仍是医学界的一个难题。

非肥胖糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠是研究SS的经典动物模型[3]。NOD小鼠随着年龄增长自发出现SS样疾病表现，12～16周发生唾液腺淋巴细胞浸润，唾液分泌功能降低，炎症进一步加重[4]。

环孢素A(cyclosporine A, CsA)是20世纪70年代发现的免疫抑制剂，因其强大的免疫抑制作用，最先应用于器官移植后的免疫排斥[5]，也用于自身免疫性疾病[6]。

* P<0.05, # P<0.01, vs. control group; 14 weeks (n=7), 21 weeks (n=6).图1 NOD小鼠刺激性唾液流率变化Figure 1 Variation in the stimulated saliva flow rate of NOD mice

A, HE staining of 14 weeks NOD mice; B, HE staining of 21 weeks NOD mice; C, FS of submandibular glands; D, the ratio index representing the ratio of the lymphocytic foci area to the total area of glandular tissue. Control, the control group; Low, the low dose group; High, the high dose group; FS, focus score. 14 weeks (n = 7), 21 weeks (n = 6), *P<0.05, # P<0.01, vs. control group.图2 14周龄和21周龄NOD小鼠下颌下腺组织病理学改变Figure 2 Histopathological changes of the submandibular glands of 14 weeks and 21 weeks NOD mice

A, TUNEL and DAPI staining of 14 weeks NOD mice; B, TUNEL and DAPI staining of 21 weeks NOD mice; C, percentage of apoptotic cells. TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling; DAPI, 4’, 6-diamidino-2-phenylindole. Control, the control group; Low, the low dose group; High, the high dose group. 14 weeks (n = 7), 21 weeks (n = 6), P > 0.05 vs. control group.图3 14周龄和21周龄NOD小鼠下颌下腺细胞凋亡情况Figure 3 Cell apoptosis in the submandibular gland of 14 weeks and 21 weeks NOD mice

A, 14 weeks (n = 7); B, 21 weeks (n = 6); * P < 0.05, # P < 0.01, vs. control group. TNF-α, tumor necrosis factor α; IFN-γ, interferon γ; IL-4, interleukin 4; IL-13, interleukin 13; IL-17F interleukin 17F; IL-22 interleukin 22; IL-23a, interleukin 23a.图4 14周龄和21周龄NOD小鼠下颌下腺炎症细胞因子表达水平Figure 4 Levels of cytokines in the submandibular gland of 14 weeks and 21 weeks NOD mice

眼干是SS的主要症状之一，眼科在治疗SS所致中至重度眼干时，常采用局部应用CsA滴眼液，缓解眼干症状[7]。局部用药方法简便，副反应小。唾液腺位置表浅，导管与口腔相连，可以采取经导管给药的方式[8]，因此，唾液腺局部应用CsA对SS的治疗作用是很值得研究的课题。

本研究拟以NOD小鼠为研究对象，探讨局部应用CsA对下颌下腺分泌功能及炎症的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物

雌性NOD小鼠购于北京大学医学部实验动物科学部，SPF级环境饲养。所有实验操作符合动物实验伦理规范，本研究获得北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准(LA2019215)。

1.2 实验试剂

CsA购自北京索莱宝科技有限公司，Trizol试剂购自美国Thermo Scientific公司，5×All-In-One RT Master Mix逆转录试剂盒购自加拿大Applied Biological Materials公司，2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒购自美国Bimake公司，In Situ Cell Death Detection Kit购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。

1.3 NOD小鼠分组及下颌下腺局部注射CsA

雌性NOD小鼠14周龄21只，21周龄18只，各周龄小鼠随机均分为3组：(1)对照组：下颌下腺注射生理盐水50 μL；(2)低剂量组：下颌下腺注射0.05%(质量分数) CsA 50 μL；(3)高剂量组：下颌下腺注射0.1%(质量分数) CsA 50 μL。术前小鼠禁食6 h[9]，自由饮水，称重，选取空腹血糖水平 ≤ 11 mmoL/L的小鼠[10]。腹腔注射戊巴比妥(80 mg/kg体质量)麻醉，切开颈部皮肤，暴露双侧下颌下腺，使用50 μL微量进样器进行多点注射。术后生理盐水冲洗，6-0可吸收缝合线缝合伤口。1周后采集实验样品。

1.4 刺激性唾液流率的测定，样本的采集及保存

小鼠麻醉方式同第1.3小节，腹腔注射M受体激动剂毛果云香碱(0.05 mg/100 g体质量)， 5 min后收集唾液，收集时间10 min，称量离心管，以1 μg=1 μL换算为体积，计算刺激性唾液流率[μL / (min·100g体质量) ]。

经眼眶采血置于离心管，静置,离心后吸取血清，-80 ℃保存。用第1.3小节方法暴露下颌下腺，显微镊剥离小鼠下颌下腺，一侧下颌下腺使用4%(质量分数)多聚甲醛固定，另一侧腺体置于离心管-80 ℃保存。

1.5 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining， HE)染色切片观察NOD小鼠下颌下腺炎症浸润灶

用4%多聚甲醛固定下颌下腺24 h，常规脱水，石蜡包埋，连续切片(切片厚度5 μm)，HE染色。光学显微镜下观察HE切片，局部 ≥ 50个淋巴细胞为一个浸润灶。用徕卡图像分析系统计数淋巴细胞浸润灶的数量，并计算灶性指数(focus score, FS, 淋巴细胞浸润灶个数/4 mm2)和淋巴细胞浸润灶的面积比(淋巴细胞浸润灶面积/该切片腺体组织面积)。

1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测下颌下腺炎症细胞因子的表达

研磨下颌下腺组织，用Trizol试剂提取RNA，使用5×All-In-One RT Master Mix预混液逆转录为cDNA，2×SYBR Green qPCR Master Mix预混液进行qRT-PCR，检测下颌下腺中炎症细胞因子的mRNA表达。每一样本做3个平行复孔，数据分析用 2-ΔΔCt法，GAPDH作为内参照，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.7 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法检测NOD小鼠下颌下腺细胞凋亡

对下颌下腺石蜡切片脱蜡，滴加蛋白酶K，用磷酸盐缓冲液洗涤。用破膜剂常温孵育，按切片数量和组织大小取Tunel试剂盒内适量酶溶液和标记溶液混合，滴加至组织。PBS洗涤后滴加4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液，用抗荧光淬灭封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察并采集图像。选取5个高倍镜视野进行计数，计算凋亡细胞阳性比例[11]。

1.8 小鼠血清肝肾功能分析

用全自动生化分析仪检测血清，检测指标为血清肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、尿酸(uric acid, UA)、丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、白蛋白(albumin, ALB)和γ-谷氨酰基转移酶(γ-glutamyl transferase，GGT)。

1.9 统计学分析

数据均采用均数±标准误表示，采用Kruskal-Wallis检验、Dunnett’s T3检验、One-way ANOVA以及Bonferroni’s检验。统计学处理及作图均通过GraphPad Prism 8.0软件完成，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 刺激性唾液流率的检测

在实验终点收集刺激性唾液，计算刺激性唾液流率，评价唾液腺分泌功能，结果显示21周龄对照组NOD小鼠刺激性唾液流率较14周龄对照组NOD小鼠减少，提示随着唾液腺炎症的进程，小鼠唾液腺分泌功能受损加重。局部注射CsA 1周后，14周龄NOD小鼠低剂量组和高剂量组刺激性唾液流率均较同龄对照组明显增加(P<0.01或P<0.05)， 即使是21周龄的晚期SS小鼠，低剂量组和高剂量组刺激性唾液流率均较同龄对照组明显增加(P<0.05，图1)， 表明NOD小鼠下颌下腺局部注射CsA后唾液分泌量有所增加。

2.2 下颌下腺的组织病理学改变

显微镜下观察NOD小鼠下颌下腺HE染色切片，14周龄和21周龄的对照组NOD小鼠，下颌下腺腺小叶结构存在，小叶内出现程度不等的淋巴细胞浸润，形成数量不等的典型的淋巴细胞浸润灶，腺泡减少，导管增生，未见明显纤维组织形成(图2A、B)。14周龄和21周龄小鼠低剂量组和高剂量组与对照组相比淋巴细胞浸润程度减轻。对NOD小鼠淋巴细胞浸润灶进行定量分析，一个指标是灶性指数(淋巴细胞浸润灶个数/4 mm2，图2C)，14周龄NOD小鼠低剂量组、高剂量组和对照组相比灶性指数显著减少(分别为P<0.01和P<0.05)。21周龄NOD小鼠低剂量组和高剂量组的灶性指数低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。另一个指标是淋巴细胞浸润灶面积比(图2D)，14周龄 NOD小鼠低剂量组及高剂量组的平均面积比均明显低于对照组(分别为P<0.01和P<0.05)。21周龄NOD小鼠低剂量组和高剂量组的灶性指数低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 下颌下腺细胞的凋亡

用TUNEL法检测NOD小鼠下颌下腺中细胞的凋亡，在腺体组织和淋巴细胞浸润灶中均可观察到凋亡细胞(图3)， 21周龄NOD小鼠凋亡细胞多于14周龄小鼠组。14周龄和21周龄 NOD小鼠对照组的凋亡细胞数多于低剂量组和高剂量组，但凋亡细胞的百分比差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.4 下颌下腺炎症细胞因子表达的改变

为探讨CsA减轻下颌下腺炎症反应的机制，用qRT-PCR方法检测下颌下腺中炎症细胞因子的表达水平，结果显示，14 周 龄NOD小鼠下颌下腺局部注射CsA后，低剂量组肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4, IL-4)、IL-13、IL-17F表达水平较对照组差异无统计学意义(P>0.05)，IL-22、IL-23a表达水平较对照组显著升高，分别为P<0.05和P<0.01。高剂量组TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17F、IL-22、IL-23a表达水平均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05，图4A)。21周龄 NOD小鼠下颌下腺局部注射CsA后，低剂量组和高剂量组较对照组TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-23a表达水平差异无统计学意义(P> 0.05),高剂量组IL-13、IL-17F、IL-22表达水平较对照组显著升高(P<0.01，图4B)。

2.5 下颌下腺局部注射CsA的安全性

CsA最主要的副作用是肾毒性，其次是肝毒性。本研究检测了14周龄和21周龄小鼠与肝肾功能相关的血清UA、BUN、Scr、ALT、AST、GGT、ALP、ALB的变化。因目前NOD小鼠无大量统计学数据确定的肝肾功能正常参考值，本研究中以对照组为参考，分别比较低剂量组和高剂量组与对照组之间各项指标的差异，结果显示各项检测指标差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 NOD小鼠肝肾功能Table 2 NOD mice liver and renal function

3 讨论

口干是SS的重要主诉，目前SS重度口干缺乏成熟有效的治疗方法。基于CsA滴眼液在SS中重度眼干患者中的有效应用[7]，本研究试图探讨下颌下腺局部用CsA对SS唾液腺的影响。

NOD小鼠是常用的SS动物模型，下颌下腺7～8周时即可出现少量淋巴细胞浸润，称为初始期；12～16周炎症细胞浸润较为明显，相当于SS发病前期；20～24周炎症进一步加重，相当于发病后期[3-4]。为此，本研究选择14周龄和21周龄NOD小鼠分别代表SS的发病前期和后期。

本研究结果显示，对照组NOD小鼠14周龄时刺激性唾液流率降低，21周龄时进一步下降，表明随着病期的延长，NOD小鼠的唾液分泌功能进一步下降，而下颌下腺局部注射CsA后的NOD小鼠，无论是低剂量组还是高剂量组，14周龄和21周龄的刺激性唾液流率均较对照组明显增加，表明NOD小鼠下颌下腺局部注射CsA后唾液分泌功能有所改善，局部用CsA可能对SS导致的口干具有缓解作用。

SS的组织病理学特征是大量淋巴细胞浸润，腺泡细胞减少，腺实质萎缩。2016年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟发布了《2016 美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟原发性干燥综合征分类标准》，其中一条为活检病理淋巴细胞浸润灶性指数≥1[12]。淋巴细胞浸润程度通常认为与唾液腺功能障碍密切相关[13]。本研究NOD小鼠下颌下腺的组织病理学观察结果显示，下颌下腺局部注射CsA后，14周龄NOD小鼠低、高剂量组的平均淋巴细胞浸润灶性指数及浸润灶面积与对照组相比明显下降或缩小；21周龄NOD小鼠低、高剂量组和对照组的差异没有统计学意义，但仍可见其下降或缩小的趋势，这可能是NOD小鼠下颌下腺局部注射CsA后唾液分泌功能得以改善的病理学基础。唾液腺上皮细胞凋亡明显增加是SS的病理学特征，也可能是SS唾液腺功能下降的重要原因之一。本研究结果显示，对照组NOD小鼠14周龄时凋亡细胞明显增多，21周龄时进一步增多。下颌下腺局部注射CsA后，14周龄和21周龄 NOD小鼠的凋亡细胞数有所减少，但差异没有统计学意义。

促炎细胞因子的表达水平一定程度上反映了炎症反应的活动度[14]。研究发现,NOD小鼠下颌下腺中淋巴细胞浸润的增加通常伴随着细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ和TNF-α的mRNA表达增加[15]。T细胞、B细胞均对下颌下腺的炎症发展有重要作用，淋巴细胞浸润灶处可见到树状细胞和巨噬细胞，SS患者中也有相似的情况[16]。本研究对多种炎症细胞因子进行了检测，其中TNF-α、IFN-γ是Th1细胞因子，IL-4、IL-13是Th2细胞因子，IL-17F、IL-22是Th17细胞因子[17]，IL-23a是由树状或巨噬细胞分泌的细胞因子[18]，结果显示高剂量组14周龄IL-13、IL-17F、IL-22、IL-23a的表达水平较对照组有下降趋势，但21周龄 IL-13、IL-17F、IL-22表达仍有明显上升。局部注射CsA对下颌下腺中炎症细胞因子以及相关蛋白的影响尚需进一步研究。

CsA是较为传统的免疫抑制剂，具有明确的免疫调节作用，广泛应用于器官移植后免疫排斥的预防，也应用于自身免疫病的治疗[17]。CsA代谢中间产物对肾脏负担较大，同时CsA也会经肝脏分解，因此，其毒副反应主要是肝肾毒性[18]。为此，本研究检测了CsA下颌下腺局部应用后的肝肾功能，包括肾功三项(UA、BUN、Scr)和肝功五项(ALT、AST、ALP、ALB、GGT)， 以对照组作为参考，结果显示，低剂量组和高剂量组的NOD小鼠，其肝肾功能的检测数据与对照组之间差异无统计学意义，表明在这个剂量范围内用药是安全的。

关于CsA局部用药药物浓度的选择，美国食品药品监督管理局指出，对于临床试验初始最大安全剂量，局部应用的药物应以浓度为准，不需根据体质量或体表面积计算[19]。参照CsA滴眼液的眼科用药[7, 20-21]，我们把CsA的药物浓度设定为0.05%和0.1%两组，比较两组之间作用及安全性的差异，结果显示，浓度为0.05%的低剂量组与未经治疗的对照组相比，NOD小鼠唾液流率增加、下颌下腺组织中平均淋巴细胞浸润灶性指数及浸润灶面积比减小，均显示明显的治疗效果。相对高剂量组(0.1%)， 上述指标与未经治疗的对照组相比有明显改善，与低剂量组相比没有进一步提高，但肝肾功能在正常范围，说明并没有因剂量提高而增加毒性反应。基于在作用有效的前提下低剂量组首选的原则，在进一步研究或临床应用中0.05%是推荐浓度。

综上，CsA下颌下腺局部注射用药可以降低NOD小鼠下颌下腺组织平均淋巴细胞浸润灶性指数和浸润灶面积比，减轻炎症反应，提高NOD小鼠的刺激性唾液流率，改善唾液分泌功能。采用浓度为0.05%和0.1%的CsA下颌下腺局部注射，NOD小鼠的肝肾功能无异常，安全性良好。两组均有改善唾液分泌功能的作用，0.05%可以作为推荐药物浓度。