乳房炎3种病原菌DNA提取方法比较研究

刀筱芳，杨有文，傅 雪，杨发龙

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

乳房炎是威胁山羊养殖最为常见的疾病之一，特别是随着养殖方式从传统的放养向规模化养殖的转变，其发病率提高，危害更为突出。

多种病原微生物与羊乳房炎的发生相关，其中主要以大肠埃希氏菌、葡萄球菌和链球菌为主，占乳房炎致病菌总数的80%～90%[1-2]，并具有经济和流行病学上的重要性。快速和准确的病原鉴定对于乳房炎的诊断和合理治疗至关重要[3]。由于传统的细菌分离鉴定过程费时耗力，无法作为常规手段用于山羊乳房炎的诊断。因此，PCR等分子生物学技术已成为诊断乳房炎的重要手段。采用PCR进行特异和敏感检测的前提条件是要从样本中制备良好的病原DNA。然而，由于不同的样本其成分存在很大差异，且常存在一些影响DNA提取效率的物质及抑制PCR扩增的因子，从而导致其敏感性下降[4]。因此，在利用PCR等分子检测技术对山羊乳房炎进行诊断和病原检测时，极有必要对羊乳中相关病原DNA的提取方法进行筛选和优化[5-7]。

本研究对3种方法提取山羊乳中致乳房炎病原菌基因组DNA的效果进行评价，特别是对后续PCR检测的影响进行了比较，以期为今后利用PCR等分子检测手段对羊乳房炎病原的检测提供方法学上的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及健康山羊乳 金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠埃希氏菌为西南民族大学四川省高等学校重点实验室保存；健康山羊乳采集自无隐性及临床乳房炎的母羊，经细菌分离和鉴定为上述病原菌阴性。

1.1.2 主要试剂 TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技有限公司产品；CTAB抽提液、蛋白酶K、饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、SDS、EDTA，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；PremixTaq、DNA Marker DL 2 000，TaKaRa公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪(ETC 811)，苏州东胜兴业科技仪器有限公司产品；超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop One)，Thermo Fisher公司产品；凝胶成像系统(Doc 2000)、荧光定量PCR仪(CFX96)，美国Bio-Rad公司产品；超纯水仪(Milli-Q)，法国Millipore公司产品；高速离心机(5417R、5804R)，德国Eppendorf公司产品；核酸电泳仪(JY300C)，北京君意东方电泳设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 含不同浓度细菌的羊乳样本制备 在健康山羊乳中分别加入不同浓度的3种病原菌，从而模拟含有不同菌体浓度的患乳房炎山羊的羊乳。分别取0.02 mL不同浓度的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌菌液，共同加至0.94 mL羊乳中，最终制备成每1 mL健康山羊乳中含有1×106CFU～100CFU致病菌的羊乳样本。另将0.06 mL生理盐水加入0.94 mL健康山羊乳中，作为阴性对照。

1.2.2 总DNA提取 分别采用TIANamp Bacteria DNA Kit、酚/氯仿法和CTAB/NaCl法，从上述含不同浓度细菌的羊乳样本中提取总DNA，各方法主要过程如下。

酚/氯仿法[8]：取1 mL羊乳，10 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀中加入500 μL STE、20 μL 100 g/L SDS、20 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混匀后置于56℃水浴消化3 h。加入500 μL酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀后10 000 r/min离心4 min。吸上清，加入500 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，10 000 r/min离心3 min后取上清液，加入30 μL 5 mol/L的NaCl，1 000 μL预冷无水乙醇，混匀，10 000 r/min离心3 min，弃上清，沉淀中加入500 μL 700 mL/L 乙醇，10 000 r/min离心2 min，弃乙醇，晾干后向沉淀中加入100 μL TE溶解，置-20℃保存。

CTAB/NaCl法[9]：取1 mL羊乳，10 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀中先后加入75 μL TE、5 μL 100 g/L SDS，38 μL 5 mol/L NaCl 溶液、38 μL CTAB 缓冲液，于65℃温育20 min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混匀，于10 000 r/min 离心5 min；加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，然后与上清液混匀，10 000 r/min 离心5 min；将上清液移至新管中，加入0.6倍体积异丙醇混合静置10 min后，于10 000 r/min离心5 min；弃上清液，加700 mL/L 乙醇洗涤，于12 000 r/min 离心2 min，弃上清液，取 100 μL的TE溶解，置-20℃保存。

TIANamp Bacteria DNA Kit提取羊乳中细菌DNA按产品说明书进行。

1.2.3 不同方法提取DNA的浓度及纯度评价 为了比较上述3种方法从羊乳中提取的总DNA的浓度和纯度，分别采用3种方法从1 mL含有106CFU各致病菌的羊乳中提取总DNA，使用Thermo Fisher NanoDrop One超微量核酸蛋白测定仪测定提取的DNA OD 260/OD 280值和浓度。

1.2.4 引物设计及合成 按文献[10]报道，合成检测3种病原菌的特异性引物，引物序列见表1，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.5 不同方法提取致病菌DNA的PCR扩增 为评价3种方法提取DNA的效果以及最终对各病原进行PCR检测的影响，以上述用不同方法提取的、含有不同浓度细菌的羊乳DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30 s、退火(金黄色葡萄球菌为64℃；无乳链球菌60℃；大肠埃希氏菌为53℃) 30 s、72℃ 40 s，35个循环；最后72℃ 10 min，结束反应。PCR反应体系为20 μL：去离子水6 μL，PremixTaq10 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL。PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 不同方法的提取时间及经济成本比较 根据不同方法所使用试剂及操作过程，对各方法提取含不同浓度细菌羊乳DNA所需的时间和成本进行概算和比较。

2 结果

2.1 不同方法提取的DNA浓度、纯度及完整性

结果如表2。 采用试剂盒、酚/氯仿法及CTAB/NaCl法，从每mL含有106CFU各致病菌的羊乳中提取总DNA，通过核酸蛋白测定仪测定浓度及OD 260nm/OD 280nm值。

从表2可知，TIANamp Bacteria DNA Kit以及酚氯仿法提取的DNA其OD 260/OD 280 <1.6，表明提取的DNA中有酚类或蛋白残留；从获取的DNA浓度来看，酚/氯仿法提取的DNA浓度最高，其次为CTAB/NaCl法，而试剂盒所得DNA浓度最低。

表2 不同方法提取总DNA的纯度和浓度

2.2 不同提取方法对乳房炎主要病原菌PCR检测的影响

将不同浓度的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌分别加入到山羊乳中，并采用3种方法分别提取DNA作为模板，用3种病原的特异性PCR进行扩增，结果如图1。

可见，针对两种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和无乳链球菌)，采用商品化试剂盒和CTAB/NaCl法提取DNA后，能从每mL含有100 CFU细菌的样本中检测到目标片段，采用酚/氯仿法提取的DNA仅能从每mL含有104CFU菌体的样本检测到。对于大肠埃希氏菌，3种方法提取DNA的效果相同，能成功从每mL含有103CFU菌体的样本检测到。上述试验经3次重复，结果一致。

A.金黄色葡萄球菌;B.无乳链球菌;C.大肠埃希氏菌;Ma.DNA标准DL 2 000；Mb.DNA标准DL 1 000; N.无模板对照；1～7.病原浓度分别为1.0×106、1.0×105、1.0×104,、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100 CFU

2.3 成本及时间效率概算

为进一步评价各方法提取DNA的时间效率以及经济成本，对各方法提取一个样本所需时间和经济成本进行概算，结果见表3。从所需时间上看，试剂盒法所需时间最短，而酚/氯仿法所需时间最长，近3 h。从经济成本估算，试剂盒法成本最高，CTAB/NaCl法和酚/氯仿法成本相当，为每个样本1元～1.5元。

表3 不同提取方法所需时间及经济成本概算

3 讨论

细菌感染是引起牛、羊乳房炎的重要因素。传统上需要通过细菌分离、培养及后续的染色形态观察、生化试验等方法来进行病原的鉴定，其耗时费力，且多种原因可造成分离率低。有报道显示，从患有临床乳腺炎的乳房采集的奶样中，有部分样本(20%～30%)的细菌培养是阴性的[11]。

PCR等分子检测技术已成为牛、羊乳房炎诊断和病原检测的有效手段。除传统的PCR之外，针对引起乳房炎的相关病原，已相继建立的有荧光定量PCR[11]、环介导等温扩增技术[12]和重组酶聚合酶扩增技术[13]等方法。然而，乳样中病原DNA的提取效果会严重影响PCR的检测效果，因此有研究对不同方法从牛乳中提取乳房炎相关病原的效果进行了评价和筛选[14]，但目前尚无针对山羊乳中乳房炎病原菌DNA提取方法进行筛选的报道。

本研究针对引起羊乳房炎的常见病原，即2种革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、无乳链球菌)和1种革兰氏阴性细菌(大肠埃希氏菌)，对3种常用且可行的DNA提取方法进行了比较。其中，酚/氯仿法作为经典的DNA提取方法，主要是利用十二烷基磺酸钠、蛋白酶 K、饱和苯酚和氯仿等成分有效地裂解细胞膜、去除蛋白质从而获得DNA。本研究结果表明，采用酚/氯仿法从羊乳中提取总DNA，其得率(浓度)远高于其他方法，而且蛋白及RNA污染较少，但采用该方法提取3种病原DNA后进行PCR检测时，敏感性均低于其他两种方法，特别是对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌2种革兰氏阳性细菌，其原因可能是该方法提取的DNA有酚类残留，影响PCR扩增。

基于硅胶膜的试剂盒法提取基因组 DNA 有诸多优点，如方便、快速并且可降低有机试剂对操作人员的伤害等。本研究采用硅胶膜试剂盒提取山羊乳中3种病原的DNA，提取的DNA浓度虽然较低，但采用PCR扩增时，对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测敏感性比酚/氯仿法均高100倍，表明其是乳房炎病原DNA提取的理想方法。其唯一不足是成本较高，在生产实际中，若需要检测大批量样本，需考虑经济成本问题。

CTAB/NaCl法是利用阳离子去污剂溶解细胞膜，并与核酸形成复合物可溶于高盐溶液，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。本研究采用CTAB/NaCl法所获得的DNA浓度较高，无明显的蛋白和RNA污染，所需时间大大短于常用的酚/氯仿法且成本很低。最为重要的是用该方法提取山羊乳中相关病原的DNA作为模板，PCR检测敏感性与试剂盒法相同。其不足是提取DNA前仍需准备相关试剂，没有商品化试剂盒方便。

总之，本研究比较了3种方法对羊乳中致乳房炎的主要3种病原菌DNA的提取及PCR检测的影响。总体评价表明，CTAB/NaCl法具有成本低、时间较短且操作简单的优点；基于硅胶膜的商品化试剂盒有成套试剂，具有安全、方便和快速的优点，但成本较高；而常规的酚/氯仿法提取效果较差且耗费时间较长，因此不适合用于山羊乳房炎病原分子检测时DNA的提取。