miR-155靶向Nrf2/HO-1通路对高糖作用下视网膜血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

黎昌江，陈方安，洪娟，李秋慧

(琼海市人民医院 眼科，海南 琼海 571400)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种常见的但是可预防的糖尿病微血管并发症，是全球失明或严重视力丧失的主要原因[1]。眼后视网膜内皮细胞结构和功能的改变是DR慢性进程的重要起始点，然而，其中涉及的细节机制尚未完全弄清[2]。因此，仍然迫切需要阐明调节高糖引起的氧化应激和炎症的分子机制。微小RNA(miRNAs)广泛存在于真核细胞中，是一组参与调控众多生物学过程的精细调节器，包括细胞增殖、分化、凋亡、氧化应激损伤等[3]。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠模型视网膜组织中存在大量差异性表达的miRNAs[4]。miR-155作为miRNAs家族的重要成员之一，Gao等[5]证实高糖处理后的人内皮祖细胞中其表达上调，进而促进高糖诱导的细胞凋亡以及氧化应激损伤。本研究以高糖作用下视网膜血管内皮细胞为模型，拟探讨miR-155对视网膜血管内皮细胞损伤的影响及其机制，进而为DR的治疗提供一种潜在的新的治疗靶点。

A. CCK-8法检测高糖对HRECs存活率的影响；B. RT-qPCR法检测高糖对HERCs miR-155表达的影响(与0 mmol·L-1D-葡萄糖组相比，a P<0.001)

1 材料和方法

1.1 细胞

人视网膜血管内皮细胞(HRECs)购自美国Sciencell 实验室。

1.2 主要试剂及仪器

L-DMEM培养基购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；Annexin V-FITC/PI 流式细胞检测试剂盒购自美国BD公司； CCK-8 试剂盒、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)检测试剂盒和蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物研究所；双荧光素酶报告试剂盒购自美国Promega公司；miR-155 inhibitor及其相应的阴性对照品均由上海吉玛基因公司合成；免疫印迹一抗Nrf2和HO-1购自美国ABGENT公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及分组 HRECs在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，同时在培养液中添加 100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1链霉素。培养条件为: 37 ℃、体积分数5% CO2。取对数生长期细胞，分为正常组、高渗组、高糖组、高糖+miR-NC组、高糖+miR-155-i组、高糖+miR-155-i+siNC组、高糖+miR-155-i+siNrf2组。正常组细胞用含有5.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培养基培养48 h；高渗组细胞用含有50 mmol·L-1甘露醇的培养基培养48 h；高糖组细胞用含有30 mmol·L-1D-葡萄糖的培养基培养48 h；高糖 +miR-NC组细胞转染miRNA scramble后用30 mmol·L-1D-葡萄糖的培养基培养48 h；高糖+miR-155-i组细胞转染miR-155 inhibitor后用30 mmol·L-1D-葡萄糖的培养基培养48 h；高糖+miR-155-i+siNC组细胞分别转染miR-155 inhibitor和siRNA空质粒后用30 mmol·L-1D-葡萄糖的培养基培养48 h；高糖+miR-155-i+siNrf2组细胞分别转染miR-155 inhibitor和Nrf2 siRNA后用30 mmol·L-1D-葡萄糖的培养基培养48 h。

1.3.2 细胞转染 用LipofectamineTM2000脂质体(美国Invitrogen公司)介导法将50 nmol·L-1miR-155 inhibitor、200 nmol·L-1Nrf2 siRNA或相对应的阴性对照转染至HRECs中。在37 ℃培养8 h后，更换为完全培养基(含有10%FBS，100 U·ml-1青-链霉素，5 ng·ml-1β-ECGF)再培养48 h。然后，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，证实转染效率后，转染细胞用于后续研究。

1.3.3 RT-qPCR实验 用TRIzol试剂盒提取总RNA。用OD260 nm/OD280 nm方法测定RNA的质量。miRNA和mRNA的逆转录分别用TaqMan microRNA反转录试剂盒和PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行。然后用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在ABI PRISM 7000序列检测系统上进行PCR。反应条件为：95℃ 预 变 性 30 s；94 ℃变性5 s， 60 ℃退火 30 s，72 ℃ 30 s 扩增，40个循环；72 ℃ 延伸 10 min。U6 mRNA为miR-155内参，GAPDH为mRNA内参。归一化后用2-ΔΔCt法计算和定量miRNA 及mRNA的相对表达水平。miR-155正向引物为5′-GGGTTTTTGCCTCCAACTGA-3′，反向为5′-CGGCAGCAATTTGTTCCATGT-3′；U6 mRNA正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。Nrf-2 mRNA正向引物为5′-CTGCCAGAGAGTGATCCGAG-3′，反向为5′-TCCGGAGCCCCTAAGTTTG-3′；GAPDH mRNA正向引物为5′-AAGGGCCCTGACAACTCTTT-3′，反向为5′-CTCCCCTCTTCAAGGGGTCT-3′。

1.3.4 CCK-8实验检测细胞存活率 取对数生长期的HRECs接种于96孔板上，经不同浓度(0、5.5、10、20、30、50 mmol·L-1)D-葡萄糖处理，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中分别于细胞转染后的24、48、72 h加入10 μl的CCK-8试剂，继续孵育2 h后，于490 nm波长下测光密度值(OD)。

1.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡 应用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡分析。上述各组细胞处理48 h后，收集约1×104个细胞，并用500 μl 结合缓冲液重悬。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI在4 ℃黑暗条件下孵育15min后，用BD FACS Canto II流式细胞仪分析细胞增殖情况。

1.3.6 流式细胞术检测细胞内ROS含量 以2′,7′-二氯二氢荧光素乙酸酯(DCFH-DA)探针检测细胞内ROS水平。然后用流式细胞仪检测DCF信号强度，以定量细胞内产生的ROS。HRECs经胰蛋白酶消化后，用含DCFH-DA的无血清培养基在37 ℃培养20 min，以1 000 r·min-1离心5 min，弃置过滤液，用PBS洗涤3次。细胞在BD FACS Canto II流式细胞仪上进行分析。数据用FlowJo 7.6软件进行分析。

1.3.7 酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清中氧化应激指标 氧化应激相关的生物标志物包括MDA、SOD、GSH-Px。上述各组细胞培养48 h后，收集上清液，采用蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。采用ELISA试剂盒测定细胞上清液中SOD活性和MDA、GSH-Px含量。

1.3.8 蛋白印迹法(Western blotting)实验 上述各组细胞培养48 h后，收集细胞，加入细胞裂解缓冲液裂解5 min。采用细胞核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒提取细胞质/细胞核蛋白以及细胞总蛋白。采用BCA法检测蛋白质浓度。取等量蛋白样本经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移到PVDF膜上。用5% 脱脂牛奶PBS孵育2 h，然后在4℃下与初级抗体[Nrf2抗体(1∶30)，HO-1抗体(1∶500)]孵育过夜。与辣根过氧化物酶结合的二级抗体在室温下孵育2 h。用化学发光检测试剂盒可视化蛋白质条带，并用Image-pro plus 6.0软件进行分析。数据被规范化GAPDH或Lamin-B作为内部控制。

1.3.9 双荧光素酶报告基因检测 目标靶基因是通过Targetscan (http://www.targetscan.org/)和microrna.org (http://www.microrna.org/)预测出来的。将含有miR-155互补结合序列的Nrf2 mRNA-3′ UTR野生型或3′UTR突变体插入荧光素酶报告基因pmirGLO双荧光素酶载体中，合成了pmirGLO-Nrf2-3′UTR野生型载体质粒和pmirGLO-Nrf2-3′UTR突变型载体质粒。在24孔平板中接种HRECs(5.0×104ml-1)，当细胞融合达到60%左右时，更换为无胎牛血清的培养基进行饥饿培养12 h，然后将pmirGLO-Nrf2-3′UTR野生型或突变型载体质粒与miR-155 mimics、miR-155 inhibitor、阴性对照或pRL-TK Renilla荧光素酶报告基因用脂质体法共转染入细胞。在共培养48 h 后，用荧光素酶测定试剂盒测定荧光素酶活性。并将荧光素酶信号归一化为肾素酶荧光信号。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 高糖对HRECs存活率和miR- 155表达的影响

经不同浓度(0、5.5、10、20、30、50 mmol·L-1)D-葡萄糖处理HRECs，随着D-葡萄糖浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率均逐渐降低；当作用24 h时，HRECs存活率均>70%；当作用48 h时或72 h，D-葡萄糖浓度≥30 mmol·L-1时，HRECs存活率<70%，但是组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1A。另外用30、50 mmol·L-1D-葡萄糖分别作用于HRECs 48 h和72 h，miR-155相对表达量较0 mmol·L-1D-葡萄糖组细胞均显著上调，差异有统计学意义(P<0.001)，但是30、50 mmol·L-1D-葡萄糖作用48 h 或72 h时HRECs中miR-155相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1B。但是考虑到临床实际意义，选择30 mmol·L-1D-葡萄糖作用细胞48 h。

2.2 转染效果验证

经RT-qPCR法检测，正常组、阴性组和miR-155-i组miR-155相对表达量分别为1.00±0.03、0.98±0.07、0.52±0.08，差异有统计学意义(F=144.983，P<0.001)；与正常组和阴性组相比，miR-155-i组miR-155相对表达量降低(P<0.001)。正常组、阴性组、miR-155-i组、miR-155-i+siNC组和miR-155-i+siNrf2组细胞Nrf2 mRNA相对表达量分别为1.00±0.07、1.02±0.08、1.76±0.23、1.80±0.27、0.87±0.04，差异有统计学意义(F=58.721，P<0.001)。与正常组和阴性组相比，miR-155-i组和miR-155-i+siNC组细胞Nrf2 mRNA相对表达量升高；而与miR-155-i组和miR-155-i+siNC组相比，miR-155-i+siNrf2组细胞Nrf2 mRNA相对表达量降低(P<0.001)。证实转染成功，可用于后续实验。

2.3 下调miR- 155表达对各组细胞凋亡活性的影响

经流式细胞仪检测，正常组、高渗组、高糖组、高糖+miR-NC组、高糖+miR-155-i组、高糖+miR-155-i+siNC组、高糖+miR-155-i-siNrf2组细胞凋亡率分别为(4.57±1.23)%、(7.20±1.35)%、(39.26±5.35)%、(41.33±6.48)%、(23.40±4.85)%、(25.16±4.73)%、(34.55±5.83)%，差异有统计学意义(F=78.751，P<0.001)；与正常组和高渗组相比，高糖组细胞凋亡率增加；与高糖组和高糖+miR-NC组相比，高糖+miR-155-i组细胞凋亡率降低；而沉默Nrf2表达后，高糖+miR-155-i-siNrf2组细胞凋亡率则被逆转(P<0.001)。见图2。

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡

2.4 下调miR- 155表达对各组细胞氧化应激水平的影响

比较各组细胞中SOD、GSH-Px、MDA和ROS含量，差异有统计学意义(F值分别为100.891、46.389、135.609、54.453，均P<0.001)。与正常组和高渗组相比，高糖组HRECs细胞中SOD、GSH-Px的含量显著降低，同时MDA和ROS含量显著升高(均P<0.001)。然而，与高糖组和高糖+miR-NC组相比，高糖+miR-155-i组SOD、GSH-Px的含量显著升高，同时MDA和ROS含量显著降低(均P<0.05)；与高糖+miR-155-i组和高糖+miR-155-i+siNC组相比，高糖+miR-155-i+siNrf2组SOD、GSH-Px、MDA的含量显著降低，同时ROS含量显著升高(均P<0.05)。见表1、图3。

表1 下调miR-155表达对高糖作用下HRECs细胞中氧化应激指标的影响

图3 各组细胞中ROS的生成水平

2.5 下调miR- 155表达对Nrf2/HO- 1通路相关蛋白的影响

比较各组细胞质和细胞核Nrf2蛋白以及细胞总蛋白中HO-1蛋白相对表达量，差异有统计学意义(F值分别为89.153、137.298、156.988，均P<0.001)。与正常组和高渗组相比，高糖组HRECs中细胞质和细胞核Nrf2蛋白以及细胞总蛋白中HO-1蛋白相对表达量显著下调(均P<0.05)。然而，与高糖组和高糖+miR-NC组相比，高糖+miR-155-i组Nrf2和HO-1蛋白相对表达量显著上调(均P<0.05)；与高糖+miR-155-i组和高糖+miR-155-i+siNC组相比，高糖+miR-155-i+siNrf2组Nrf2和HO-1蛋白相对表达量显著下调(均P<0.05)。见表2、图4。

表2 下调miR-155表达对高糖作用下HRECs中Nrf2/HO-1通路相关蛋白的影响

泳道1～7分别为正常组、高渗组、高糖组、高糖+miR-NC组、高糖+miR-155-i组、高糖+miR-155-i+siNC组、高糖+miR-155-i+siNrf2组

2.6 miR- 155靶基因预测及生物信息学分析结果

根据数据库预测，Nrf2 mRNA是miR-155的靶基因。在 Nrf2的3′UTR内发现了一个特定的miR-155结合位点。为了进一步评估Nrf2 mRNA是否是miR-155的直接靶标，构建了含有Nrf2 3′-UTR的荧光素酶报告载体，其中包括荧光素酶基因(pGL3-Nrf2)下游的假定靶标蛋白(target site)和突变型(pGL3-Nrf2-MUT)。报告载体与miR-155 mimics及Nrf2-3′UTR-WT共转染 HRECs，结果显示荧光素酶活性显著降低(F=16.441，P<0.05)；相反，转染pGL3-Nrf2-3′UTR-WT载体和miR-155 inhibitor后HRECs荧光素酶活性显著增加(F=15.359，P<0.05)。见图5。

图5 HRECs中miR-155和Nrf2/HO-1的靶向关系

3 讨 论

DR是糖尿病最严重和最常见的并发症之一，具有特异性的眼底病理变化，其中视网膜血管内皮细胞损伤是其发生的基础[6]。DR的发生和发展涉及多种危险因素及标志物，例如miRNAs。miRNAs属于非编码RNA家族，它们通过影响信使RNA(mRNA)的稳定性来充当蛋白质翻译的负调控因子[7]。针对miRNAs的研究为提高我们对复杂生物学机制的理解提供了机会。在眼科疾病中，miRNAs控制着各种细胞的功能，如视网膜内皮细胞、视网膜色素上皮细胞等。DR的发病是一个多因素的过程。近年来，针对miRNAs在DR中的作用探索新的治疗靶点的研究越来越受到重视。Chen等[8]证实，miR-126过度表达可以保护HRECs 免受高糖诱导的前炎症反应，其作用机制与激活PI3K/AKT信号通路有关。作为miRNAs家族的一员，miR-155是由非编码RNA的外显子生成的，称为B细胞整合簇[9]。本研究就miR-155对高糖作用下视网膜血管内皮细胞氧化应激的调控作用进行了探讨并进一步研究了其机制。

DR的发病机制较为复杂，高血糖诱导视网膜血管内皮细胞氧化损伤和细胞过度凋亡是其重要致病原因[10]。氧化应激在调节细胞凋亡中起基础性作用，细胞在代谢过程中产生活性氧自由基导致氧化应激，进而对视网膜血管内皮细胞造成凋亡等一系列损伤[11]。通过CCK-8实验和流式细胞术实验发现，高糖作用下的HRECs增殖活性降低、凋亡率升高。然而，下调miR-155表达后可以促进高糖作用下HRECs的增殖活性，同时降低细胞的凋亡率。说明高糖环境对于miR-155表达有一定的调节作用，而miR-155在高糖诱导HRECs损伤过程中发挥着促凋亡作用；而敲除miR-155基因后对于HRECs高糖损伤有一定的保护作用。

ROS是生物有氧代谢的产物，ROS的形成总是伴随着抗氧化酶系统的上调，抗氧化酶系统通过清除内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px等的活性来保护组织免受过量ROS的伤害, 而氧自由基和脂质氧化的最终产物MDA则直观地反映了ROS造成的损伤[12]。进一步检测氧化应激相关指标发现，miR-155 低表达处理后SOD 和GSH-Px含量升高，MDA和ROS含量降低。在ROS刺激下机体能够通过激活一些特异性的转录因子对细胞进行保护，Nrf2/HO-1就是调节细胞氧化应激的一条重要通路[13]。miRNAs可调节许多信号通路和细胞过程，并参与细胞间的通信[14]。检索TargetScan在线数据库发现miR-155存在与Nrf2/HO-1mRNA互补的保守序列，双荧光素酶报告基因分析进一步证实了miR-155和Nrf2/HO-1mRNA之间的靶向调控关系。Nrf2是一种对氧化还原敏感的转录因子，为Cap-N-Collar转录因子家族的成员之一。Nrf2是激活抗氧反应元件的关键转录因子，通过激活启动多种细胞内抗氧化酶的表达来预防疾病的进一步发展。HO-1则属于Ⅱ相解毒酶之一，它所引发的下级信号通路对多组织具有抗氧化应激的保护作用[15]。通过免疫印迹实验发现，高糖作用下HRECs中细胞质和细胞核中Nrf2蛋白表达量下调，而敲低miR-155表达处理后细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达量则显著上调。高糖+miR-155-i+siNrf2组的处理则进一步证明，下调miR-155表达通过靶向激活Nrf2/HO-1通路进而保护高糖作用下HRECs氧化应激损伤。Nrf2现在被证明在线粒体内稳态中起着重要作用。Nrf2与调节线粒体膜电位和脂肪酸氧化有关，而高糖环境可损害视网膜线粒体并改变其膜电位。Nrf2除了可以调节糖尿病患者线粒体损伤的机制外，Nrf2信号可能与线粒体ROS也有直接的交互作用。Nrf2被激活后发生核转位，通过诱导HO-1降低线粒体及细胞内氮氧化物(NOX)产生的自由基，进而保护细胞发生氧化应激损伤。因此，Nrf2/HO-1激活可能在维持糖尿病患者视网膜线粒体稳态方面发挥着重要作用，有望成为防治或延缓糖尿病患者视网膜病变进展的重要靶点。

综上，本研究结果证实高糖可诱导HRECs miR-155表达上调，敲低miR-155表达后能够保护高糖作用下HRECs凋亡和氧化应激损伤，其机制与激活Nrf2/HO-1通路有关。尽管目前尚缺乏临床数据和动物实验，但本研究旨在提高对DR分子机制的认识，为DR治疗靶点的研究提供了新的视角和思路。