补体C9缺陷对LPS诱导的小鼠早期肝脏炎症和损伤的保护作用及机制①

吴艳红 付晓燕 于 洋 吴沛恩 许 虎 房佩佩 魏 涛 梁淑娟

（潍坊医学院基础医学院，山东省高校免疫学重点实验室，潍坊261053）

内毒素性休克是由宿主对感染的免疫反应失调引起的致命性疾病，通常引发多器官功能障碍，包括肺、肾、肝脏［1-2］。LPS是革兰氏阴性细菌外膜的组成成分，其诱导的内毒素血症模型是研究败血症及败血症休克病理生理学的重要工具［3］。研究证明LPS 与 CD14 和 Toll 样受体 4（Toll like receptor 4，TLR4）相互作用激活炎症信号并诱导促炎细胞因子的分泌，刺激炎症细胞向靶器官浸润从而导致组织损伤［4-6］。肝脏由于其独特的解剖位置，经常高度暴露于循环抗原、内毒素甚至微生物中，是抵御炎症的重要防线。肝脏可通过清除细菌、急性期蛋白以及对炎症代谢的适应等机制，对全身感染期间免疫防御的调节至关重要，同时肝脏也是内毒素休克相关损伤的重要靶标和受累器官［7-8］。

补体系统在先天性和适应性免疫反应中均起重要作用，补体激活最终形成膜攻击复合物（MAC或C5b-9）。MAC 由C5b、C6、C7、C8和多个C9组成，组装形成环形孔嵌入靶细胞膜从而裂解细胞，补体C9 是 MAC 发挥作用的重要成分［9］。近年来的研究进一步证明MAC是多种炎症的重要驱动因素，本课题组前期研究表明C9基因缺陷能够保护小鼠免于LPS 诱导的休克性死亡，其机制与下调小鼠体内炎症反应有关［10］。为进一步阐明 MAC 在 LPS 诱导的内毒素休克中的相关病理机制，考虑到肝脏是内毒素休克中多器官损伤的重要靶器官，本研究重点探讨了补体C9缺陷在LPS 诱导的早期肝脏炎症反应和损伤中的作用及病理机制，从而为临床上内毒素血症中肝脏损伤的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 野生型B6. WT（C57BL/6）、补体C9基因缺陷型（B6.C9-/ -）小鼠饲养在无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境中。所有动物研究皆根据潍坊医学院动物保护与使用委员会批准的方案进行。试验对象为8~10 周龄小鼠。LPS（0111：B4）购自 Sigma-Aldrich；ALT 和 AST 测试盒购自南京建成生物工程研究所；山羊血清购自北京中杉金桥。IF 检测用的大鼠抗小鼠F4/80-Alexa Fluor 647（F4/80-647）、兔抗小鼠 C5b-9 抗体购自Abcam；大鼠抗小鼠Gr-1 抗体购自BioLegend；山羊抗大鼠 IgG（H+L）-FITC 购自 Invitrogen；山羊抗兔IgG（H+L）-Alexa Fluor 647 购 自 Jackson Immuno Research。FACS检测用的大鼠抗小鼠CD16/CD32抗体、F4/80-APC、CD11b-FITC、CD11b-PE、Gr-1-APC、Ly6C-FITC、Ly6G-APC 均购自 Biolegend。RIPA 裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自Solarbio；小鼠IL-1β、TNF-α 检测试剂盒购自eBioscience；小鼠IL-8 检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；sMAC 检测试剂盒购自Miobiosource；逆转录试剂盒购自Thermo scientific；qPCR 试剂盒购自罗氏公司；红细胞裂解液购自Solarbio；多聚甲醛购自 sigma-Aldrich；Percoll 购自GE Healthcare。BioTek®酶标仪购自美国 Thermo 公司；正置荧光显微镜购自日本Olympus 公司；Light‐Cycler®480 Ⅱ购自罗氏公司；冷冻切片机购自美国Thermo公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS 诱导 取 8~10 周龄的 B6.WT 和 B6.C9-/ -小鼠，分为LPS 组（n=5）和对照组（n=3），LPS 组腹腔注射LPS（5 mg/kg），对照组注射等体积的生理盐水，12 h后处死小鼠，实验重复3次。

1.2.2 酶法检测血清中ALT、AST 水平 收集小鼠血清，取5 μl 血清依据试剂盒说明书检测ALT、AST的水平。

1.2.3 HE 染色观察肝脏组织病理学改变 肝脏组织经4%多聚甲醛固定后，进行常规石蜡包埋，切片厚度5 μm，经二甲苯及梯度酒精脱蜡水化后，用苏木素染色5 min，伊红复染后封片，光学显微镜下观察并采集图像，观察肝脏组织的病理损伤和炎症反应变化。

1.2.4 ELISA 检 测 血 清 中 IL-1β、IL-8、TNF-α、sMAC 水平 收集小鼠血清，依据ELISA 试剂盒说明书检测IL-1β、IL-8、TNF-α、sMAC的水平。

1.2.5 IF 检测肝脏组织巨噬细胞、中性粒细胞及MAC 沉积 肝脏组织经OCT 包埋，切片5 μm，冷丙酮固定10 min，10%山羊血清封闭1 h，用于后续检测。检测巨噬细胞时，组织用0.3%Triton X-100 破膜5 min，加入大鼠抗小鼠F4/80-647 抗体（1∶50），4℃避光孵育过夜，PBS洗涤后DAPI染色5 min，PBS洗涤后加抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。检测中性粒细胞和MAC时，组织先分别与大鼠抗小鼠 Gr-1 抗体（1∶100）、兔抗小鼠 C5b-9 抗体（1∶50）4℃孵育过夜，PBS 洗涤后，再分别与山羊抗大鼠IgG（H+L）-FITC（1∶400）和山羊抗兔IgG（H+L）-Alexa Fluor 647（1∶400）反应，然后荧光显微镜下观察。

1.2.6 ELISA 检测肝脏组织抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平 50 mg 肝脏组织加入 0.5 ml 预冷的RIPA 裂解缓冲液，冰上裂解10 min，11 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液。依据试剂盒说明书用BCA法检测组织抽提物的蛋白浓度。依据ELISA试剂盒说明书检测每200 μg 肝脏组织抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α的水平。

1.2.7 qRT-PCR 检测肝脏中 IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA 水平 小鼠肝脏组织Trizol 法提取总RNA，无RNase 水溶解后使用TAKE3TM超微量检测系统检测纯度和浓度，完全符合试验要求。取5 μg RNA依据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，按照表1所显示的序列由上海铂尚生物技术有限公司合成引物。取 2 μl cDNA 于 20 μl 反应体系中，实时荧光定量PCR 仪进行 PCR 循环扩增反应，以 β-actin 作为内参，通过 2-ΔΔCt分析 IL-1β、IL-8、TNF-α 的mRNA 水平变化。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.8 FACS 检测小鼠肝脏单个核细胞中的巨噬细胞及中性粒细胞 摘取小鼠肝脏，冰上研磨并过200 目尼龙网，细胞悬液 650 r/min，4℃ 离心 1 min。收集上清，1 500 r/min，4℃ 离心8 min。弃上清，细胞沉淀加入10 ml 红细胞裂解液冰上裂解7 min，加入PBS 终止裂解后1 500/rmin，4℃ 离心8 min。弃上清，PBS 洗涤细胞沉淀 1 次，8 ml 40% 的 Percoll 重悬细胞沉淀，2 500/rmin，4℃离心25 min，所得细胞沉淀即肝脏单个核细胞。取1×106个细胞，加入1 μl抗小鼠CD16/CD32 抗体封闭15 min，加入相应细胞群的检测抗体：CD11b-FITC、F4/80-APC 和 CD11b-PE、Ly6C-FITC 抗体标记巨噬细胞；CD11b-PE、Gr-1-APC 和 CD11b-PE、Ly6G-APC 抗体标记中性粒细胞。避光染色30 min，加入1 ml PBS 洗涤细胞2 次，1 500/rmin，4℃ 离心 5 min，用 400 μl FACS buffer重悬细胞并过滤后上机检测。

1.3 统计学分析 利用GraphPad Prism 8.0.1 统计软件进行分析，计量资料以表示，两组间均数采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补体C9基因缺陷显著降低小鼠血清中ALT、AST 水平和肝脏损伤及炎症浸润 LPS 处理后，首先检测两组小鼠血清中ALT、AST 的水平，观察肝脏功能变化。结果发现，LPS 注射组小鼠血清ALT、AST的水平均明显高于各自用生理盐水处理的对照组，且B6.C9-/ -小鼠血清中ALT、AST 的水平明显低于B6.WT 小鼠（P<0.001，图1A、B），提示C9基因缺陷后小鼠肝脏损伤较轻。同时肝脏组织HE 染色表明，LPS 处理后，B6.WT 和 B6.C9-/ -小鼠肝脏组织结构紊乱、肝脏细胞肿胀、间隙减小、局灶性炎症细胞浸润，而B6.C9-/ -小鼠肝脏组织上述病理变化明显轻于B6.WT小鼠（图1C）。

图1 血清ALT、AST水平及肝脏病理学改变Fig.1 Serum ALT，AST levels and liver pathological fea⁃tures

2.2 补体C9基因缺陷降低小鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α 水平 ELISA 检测两组小鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平。结果发现，LPS 注射组小鼠血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平明显高于各自用生理盐水处理的对照组。LPS处理后，B6.C9-/ -小鼠血清中 IL-1β（P<0.01，图 2A）、IL-8（P<0.000 1，图 2B）、TNF-α（P<0.000 1，图2C）的水平显著低于B6. WT小鼠，提示B6.C9-/ -小鼠体内炎症反应水平低于B6.WT小鼠。

图2 血清中IL-1β、IL-8、TNF-α水平Fig.2 Levels of IL-1β，IL-8，TNF-α in serum

2.3 补体C9基因缺陷显著下调小鼠肝脏组织中MAC 沉积及血清中sMAC 的水平 通过MAC 的特异性标志物进行IF 染色，分析肝脏中MAC 沉积情况，结果表明，LPS 组小鼠肝脏组织MAC 沉积显著高于各自用生理盐水处理的对照组。LPS 处理后，B6.C9-/ -小鼠肝脏中MAC 沉积（图3A）及荧光强度（P<0.01，图3B）显著低于B6.WT小鼠。同时ELISA检测小鼠血清中sMAC 水平来反映小鼠体内补体活化水平的高低，结果显示LPS 组小鼠血清中sMAC水平明显高于各自的生理盐水对照组。LPS 处理后，B6.C9-/ -小鼠血清sMAC 水平显著低于B6. WT小鼠（P<0.05，图3C），提示B6.C9-/ -小鼠体内补体活化水平低于B6.WT小鼠。

图3 肝脏组织MAC沉积情况及血清sMAC水平Fig.3 MAC deposition in liver and serum sMAC level

2.4 补体C9基因缺陷降低肝脏组织抽提物中IL-1β、IL-8 的水平 ELISA 检测两组小鼠肝脏组织抽提物（liver tissue extracts，LTE）中IL-1β、IL-8、TNF-α的水平。结果发现，LPS 组小鼠 LTE 中 IL-1β、IL-8水平明显高于各自用生理盐水处理的对照组。LPS处理后，B6.C9-/ -小鼠LTE中IL-1β（P<0.01，图4A）、IL-8（P<0.05，图4B）水平显著低于B6.WT 小鼠，而TNF-α 水平与B6. WT 小鼠相比无显著性差异（图4C）。

图4 肝脏组织抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α水平Fig.4 Levels of IL-1β，IL-8 and TNF-α in liver tissue ex⁃tracts

2.5 补体C9基因缺陷降低小鼠肝脏中IL-1β mRNA 的表达水平 qRT-PCR 检测小鼠肝脏中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA水平。结果显示，LPS组小鼠肝脏IL-1β mRNA 水平明显高于各自用生理盐水处理的对照组。LPS 处理后，B6.C9-/ -小鼠肝脏IL-1β mRNA 水平显著低于B6.WT 小鼠（P<0.05，图5A），而 IL-8、TNF-α mRNA 水平与 B6.WT 小鼠相比无显著性差异（图5B、C）。

图5 肝脏组织中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达水平Fig.5 Expression levels of IL-1β，IL-8，TNF-α mRNA in liver tissue

2.6 补体C9基因缺陷减少小鼠肝脏组织中巨噬细胞、中性粒细胞的聚集和浸润 通过巨噬细胞和中性粒细胞的特异性标志物进行IF 染色，分析肝脏中两群免疫炎症细胞亚群浸润的情况。结果表明，LPS组小鼠肝脏组织巨噬细胞（F4/80）、中性粒细胞浸润（Gr-1）显著高于各自用生理盐水处理的对照组。LPS 处理后，B6.C9-/ -小鼠肝脏巨噬细胞（图6A）、中性粒细胞（图6B）浸润显著少于B6.WT小鼠。

图6 肝脏组织中巨噬细胞、中性粒细胞的浸润情况Fig.6 Infiltration of macrophages and neutrophils in liver

2.7 补体C9基因缺陷显著减少肝脏单个核细胞中巨噬细胞及中性粒细胞的比例 小鼠肝脏单个核细胞流式测定结果显示，LPS 组小鼠肝脏单个核细胞中巨噬细胞和中性粒细胞的比例显著高于各自用生理盐水处理的对照组。为了全面分析两群细胞浸润水平的变化，使用两种常用的细胞表面标志对巨噬细胞和中性粒细胞的浸润情况进行检测。LPS 处理后，B6.C9-/ -小鼠肝脏单个核细胞CD11b+F4/80+、CD11b+Ly6C+巨噬细胞（P<0.01，图7A、B）及CD11b+Gr-1+、CD11b+Ly6G+（P<0.01，图7C、D）中性粒细胞比例显著少于B6.WT小鼠。

图7 肝脏单个核细胞中巨噬细胞及中性粒细胞的比例Fig.7 Proportion of macrophages and neutrophils in liver mononuclear cells

3 讨论

补体系统是先天性免疫的主要组成部分，是先天性和适应性免疫之间的重要纽带，由多种血浆和膜结合蛋白组成。这些蛋白质在防御病原体以及调节免疫和炎症过程中起着核心作用［11-12］。补体级联反应由3种途径激活：经典途径、替代途径和凝集素途径，3 种途径于C3 处汇聚，并导致效应分子C3a和C5a 等炎性介质产生，最终汇聚于终末成分C9 及其参与组成的 MAC（或 C5b-9）［13-14］。MAC 的许多促炎作用已将其确立为炎症的重要驱动因素［15］，例如，ALAWIEH 等［16］研究发现通过抑制补体的激活显著减弱创伤性脑损伤后的神经炎症和功能障碍；KUMAR 等［11］研究表明MAC沉积在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）视网膜中，这导致NLRP3 炎性小体激活并增加IL-1β 的产生。MAC 的炎症驱动作用使得MAC有可能作为炎症治疗的新靶点，基于补体C9 作为MAC 形成裂解孔隙的最重要成分，本研究利用补体C9基因缺陷的小鼠，更直观地探究MAC在补体相关疾病发病机理中的作用。

肝脏是重要的免疫器官，具有独特的免疫细胞群，参与先天性和适应性免疫。LPS 相关的肝损伤是败血症及其他系统性肝脏疾病患者发病和死亡的重要原因。临床研究表明，与急、慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌相关的内毒素血症的发生率高达75%~95%［17-18］。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，可在炎症动物模型中用于诱导急、慢性组织损伤［19］。已有研究表明补体系统的激活是内毒素休克中病原体防御机制的关键事件之一，MAC 形成能够激活 NLRP3 炎性小体［20］。本研究利用补体C9基因缺陷小鼠探究MAC 在LPS 诱导的肝损伤中的作用及其相关机制。通过检测小鼠血清AST、ALT 水平和HE 染色观察肝脏组织病理学变化评估肝脏损伤情况，结果显示LPS 刺激显著上调小鼠血清中AST、ALT 水平，同时肝脏HE 染色显示LPS刺激引起肝脏组织结构紊乱、肝脏细胞肿胀、间隙减小、局灶性炎症细胞浸润，而补体C9缺陷显著减轻了上述病理变化，提示补体C9缺陷对LPS 诱导的小鼠肝损伤起保护作用。研究表明LPS 对TLR4的过度激活以及随之而来的细胞因子风暴被认为是内毒素休克或败血症的基础，LPS 能与细胞膜的Toll 样受体4（TLR4）结合，激活下游炎症信号通路，进而导致炎症反应和细胞因子的产生，炎性细胞因子的大量产生是器官功能障碍并最终导致死亡的原因［21-23］。为探究补体C9缺陷在保护LPS诱导的肝损伤中涉及的炎症过程和机制，本研究对相关促炎因子进行了检测，结果表明补体C9基因缺陷显著降低 LPS 处理后小鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平。为确认补体C9 参与LPS 诱导肝损伤的免疫应答过程与MAC 相关，IF 检测肝脏中MAC 沉积，同时检测小鼠血清中sMAC 的水平，结果显示补体C9缺陷显著下调肝脏中MAC 沉积及血清sMAC 水平，提示补体C9缺陷对LPS 诱导肝损伤的保护作用与下调补体活化和MAC 沉积有关。为探究MAC 在触发或加速LPS 诱导肝损伤的免疫应答机制，对肝脏中IL-1β、IL-8、TNF-α 蛋白质和 mRNA 水平进行检测，结果显示补体C9缺陷显著降低肝脏组织抽提物中IL-1β、IL-8 水平及肝脏中IL-1β mRNA 水平，提示补体C9缺陷通过下调MAC 抑制肝脏中炎性因子的产生和释放。LPS 能够触发先天性免疫反应，巨噬细胞和中性粒细胞是先天性免疫的两种细胞类型，在急性炎症启动过程中至关重要［24］。本研究通过IF以及FACS 检测肝脏中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润情况，结果均显示补体C9缺陷显著减少肝脏中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润，提示MAC通过影响巨噬细胞以及中性粒细胞的炎症过程诱导或加速了LPS诱导的肝脏损伤。

上述研究结果提示补体C9缺陷后下调了肝脏组织中MAC 沉积，进而减少促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-α 的产生和释放，从而抑制肝脏巨噬细胞及中性粒细胞的聚集和浸润，减弱了LPS 内毒素休克中的肝脏组织损伤。进一步提示MAC 在LPS 诱导的休克相关的炎症反应中具有促进肝脏病理损伤的作用，将为临床内毒素诱导的肝损伤靶向治疗方案设计和临床治疗策略提供新的思路。