DSS诱导溃疡性结肠炎后miR-192表达及相关作用机制

蔡根深 张 晶 王汝朋 （首都医科大学附属北京世纪坛医院全科医学科，北京100038）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以结直肠黏膜弥漫性炎症为特征的慢性疾病，其典型临床症状为血腥黏液便，并具有明显的缓解期与加重期，病程较长，迁延不愈［1］。随着近年来饮食结构的改变和生活节奏的加快，我国UC 发病率正逐年上升。尽管UC 的具体发病机制尚未明确，但多数学者认为肠道免疫异常及肠黏膜屏障功能障碍在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的发病过程中起着重要作用。异常黏膜免疫反应导致炎症因子及氧化应激的失衡，而后者又进一步加剧肠黏膜免疫功能的紊乱，进而诱发肠上皮的慢性持续性损伤，最终导致UC的发生发展［2］。

MicroRNAs（miRNAs）是一类能够在转录后参与调节多种基因表达的内源性非编码RNA［3］。近年来越来越多的数据表明miRNAs 与UC 的发生发展密切相关。WU 等［4］通过 miRNAs 芯片等技术对比分析UC 患者与健康人群的结肠黏膜组织发现，miR-192 在UC 患者中的表达显著降低。VALMIKI等［5］同样发现在UC患者肠黏膜组织中包括miR-192在内的多种miRNAs 的表达显著下降，并推测这些异常表达的miRNAs 可能与结肠癌的发病机制有关。而国内学者吴一峰等［6］最新研究发现miR-192在结肠癌组织中的表达显著降低，且与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期相关。

Nrf2/HO-1 是机体重要的抗氧化信号通路，广泛存在于机体的各个组织器官中。核因子E2（nu‐clear factor E2 related factor，Nrf2）是体内抗氧化调节的重要蛋白，在细胞受到氧化刺激时，Nrf2迅速从位于胞浆的复合物中解离出来，活化后进入细胞核，进而激活下游基因如血红素加氧酶（heme oxy‐genase 1，HO-1）的转录，促进抗氧化剂的表达以增强细胞的抗氧化能力，抑制活性氧及炎症等有害物质的释放并最终发挥保护细胞功能的作用［7］。最近有研究发现，Nrf2/HO-1 信号通路能够通过影响巨噬细胞的活化，从而发挥抗炎或抑炎的作用［8］。而巨噬细胞作为肠黏膜免疫环境中含量丰富的细胞，在UC 的发展过程中具有重要地位［2］。最近在肺炎相关的小鼠模型中发现，miR-192 能够通过影响巨噬细胞的功能成为肺炎治疗新型靶点［9］。鉴于以上机制，本课题旨在探讨miR-192在UC 中表达及其对疾病进展的作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6~8周SPF级健康雄性C57BL/6小鼠40 只，体重19~23 g，购于北京维通利华生物公司，饲养于室温22~28℃，湿度为55%的SPF 级清洁动物房，自由摄食、水，12 h 昼夜周期。本实验均按照实验动物管理条例进行，并获得本院动物护理和使用委员会审核通过。

1.1.2 细胞系及主要试剂 293T 细胞购自中国科学院上海细胞库；葡聚糖硫酸钠（DSS）（美国Biosharp 公司）；DMEM/HG（美国 Hyclone 公司）；胎牛血清 FBS（杭州四季青生物公司）；Trizol、Lipo‐fectamine2000、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（美国Invitrogen 公司）；逆转录与实时定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa公司）；HE染色试剂盒（北京索莱宝公司）；SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒、HRP 标记山羊抗兔二抗（广州晶彩生物公司）；丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成公司）；ECL 发光试剂盒（美国Thermo 公司）；GFP 标记的过表达miR-192 慢病毒载体及慢病毒空载体（上海吉凯生物公司）；pmirGLO HO-1-WT、pmirGLO HO-1-MUT 的荧光素酶报告基因质粒、miR-192 mimic 及mimic-NC序列（上海吉玛）；荧光酶检测试剂盒（Pro‐mega 公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α 酶联免疫（ELISA）试剂盒（武汉博士德生物公司）；抗小鼠F4/80-APC、抗小鼠CD86-FITC、抗小鼠CD206-PE/Cy5.5（美国BD公司）；兔抗Lamin A、HO-1、Nrf2、β-actin 抗体（美国Bioworld 公司）；实时荧光定量PCR 引物（上海生工公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 40 只C57BL/6 小鼠按随机数字表法分为4组，正常对照组（Control组）、DSS 诱导的UC 模型组（DSS 组）、过表达miR-192 慢病毒组（miR-192 组）、慢病毒对照组（Negative con‐trol组，即NC 组），每组10只。实验小鼠适应性饲养1 周后，于造模前24 h 禁食不禁水。参考相关文献［10］制作UC 模型，简述如下：实验前对小鼠禁食不禁水24 h后，使用4%的水合氯醛经腹麻醉（0.1 ml/10 g），miR-192组及NC组小鼠分别经肛门轻柔缓慢的注射50 μl（1×109TU/ml）对应的慢病毒液进入肠内，注射部位距肛门约 6 cm 处，Control 组与 DSS 组小鼠注射等量的生理盐水。注射完毕后将小鼠倒立放置，并注意保暖，直至小鼠苏醒并正常进食。除Control 组以外的各组小鼠2.5%的DSS 作为饮用水连续饲养7 d，Control组小鼠以普通饮用水作为对照。实验开始后每天记录每只小鼠的体重、粪便性状及便血情况，参考文献［10-11］将小鼠的上述指标的评分总和用以评估小鼠的炎症活动指数（disease activity index，DAI），其中体重变化评分为：0 分=无下降，1分=下降<5%，2分=下降5%~10%，3分=下降11%~15%，4 分=体重下降>15%；粪便性状评分为：0 分=粪便正常，2 分=粪便松散，4 分=水样稀便；便血情况评分为：0 分=无血便，2 分=轻度血便，4 分=大量出血。第8 天脱臼后处死各组小鼠，收集各组小鼠的新鲜结肠组织部分用于流式细胞术，其余部分保存于-80℃冰箱以备后续使用。

1.2.2 HE 染色观察小鼠结肠组织病理变化 取各组小鼠结肠组织固定于4%多聚甲醛溶液中24 h后，进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋，切片后应用HE 试剂盒进行染色，每只小鼠随机选取3 张切片，光镜下观察其组织学变化。

1.2.3 ELISA 实验检测结肠黏膜组织中炎症因子表达水平 刮取各组小鼠结肠黏膜组织后进行匀浆，按照 IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10 的 ELISA 试剂盒使用方法检测各组小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10表达水平。上述实验单独重复3次。

1.2.4 结肠组织中SOD及MDA活性检测 取各组小鼠适量结肠组织进行匀浆，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪测定结肠组织中SOD及MDA水平。上述实验单独重复3次。

1.2.5 分离结肠固有层单核巨噬细胞（lamina pro‐pria mononuclear cells，LPMCs） 参考文献［12］进行分离各组小鼠LPMCs，简述如下：将小鼠结肠组织置于含 5 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT 的 HBSS溶液中，37℃振荡消化20 min，室温下1 000 r/min离心5 min，取下层沉淀再次重复上述消化步骤以充分去除肠上皮细胞。100 μm 的滤网过滤上述组织液，取未过滤出的组织置于含0.05%胶原酶D、0.05% DNaseⅠ与 0.3%Diapase Ⅱ的 PBS 溶液中，37℃振荡消化1 h。40 μm 的滤网过滤上述组织液，1 500/rmin离心10 min，取下层细胞重悬于4 ml PBS溶液中，并缓慢加入等体积的Ficoll 溶液表面上，并使其形成界面。20℃下2 400/rmin 离心20 min，下层细胞沉淀即为所需LPMCs。

1.2.6 流式细胞术检测LPMCs 中巨噬细胞极化 取各组小鼠的LPMCs 进行流式细胞仪检测，其中M1 型巨噬细胞使用 F4/80-APC 与 CD86-FITC 进行标记，M2 型巨噬细胞使用F4/80-APC 与CD206-PE/Cy5.5 进行标记。流式步骤简述如下：用PBS 将细胞密度调整至 1×105个/ml，取 2 ml 至流式管中，800/rmin 离心 5 min，弃上清后加入 100 μl 的 PBS重悬细胞，依次加入F4/80-PE、CD16/32-PerCP/Cy5.5、CD206-Alexa 647，于 4℃ 避光孵育30 min 后加入 2 ml PBS 洗涤细胞，800/rmin 离心 10 min ，弃上清，再加入 0.2 ml PBS 重悬细胞，0.22 μm 滤膜过滤后上机进行检测分析。上述实验单独重复3次。

1.2.7 细胞培养及双荧光素酶报告基因检测 将293T细胞常规复苏后用含有10%FBS与1%青链霉素的DMEM/HG 培养基置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，待细胞生长融合至80%时用0.25%的胰酶进行消化传代。应用miRNA 靶基因在线预测网站TargetScan 对miR-192 作用的靶基因进行预测，筛选HO-1 作为其可能的靶分子。将处于对数生长期的293T细胞常规消化后接种于24孔细胞培养板中，调整细胞密度至2×105个/孔，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。转染前3 h将DMEM/HG培养基更换为 Opti-MEM 培养基，根据 Lipofectamine 2000 说明书将 pmirGLO HO-1-WT、pmirGLO HO-1-MUT 的荧光素酶基因报告质粒及miR-192 mimic 及mimic-NC分别转入293T细胞中，并将细胞分为pmirGLO-HO-1-WT+miR-192 mimic、pmirGLO-HO-1-WT+mimic-NC、pmirGLO-HO-1-MUT+miR-192 mimic、pmirGLO-HO-1-MUT+mimic-NC，每组设5 个复孔，于37℃、5%CO2培养箱培养6 h后换为含10%FBS的DMEM/HG 常规培养液。转染48 h 后，按照双荧光素酶检测试剂盒说明书进行操作，检测HO-1 启动子的荧光强度。上述实验单独重复3次。

1.2.8 实时荧光定量PCR（RT-PCR） 将小鼠结肠组织组织置于液氮中研磨为组织匀浆后按照Trizol法提取组织中总RNA，分光光度计检测浓度与纯度后，根据逆转录试剂说明书逆转录为cDNA，再按照RT-PCR试剂说明书及预实验确定的反应时间与温度进行实时定量，RT-PCR 反应条件为：95℃（30 s）预变性后，变性95℃（7 s），退火60℃（30 s），72℃（15 s），40 个循环周期。RT-PCR 引物序列为：miR-192-F：5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3'，miR-192-R：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6-F：5'-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3'，U6-R：5'-CATCGAAGGTGGAAGAGTGG-3'。以 U6 为内参，采用 2-ΔΔCt方法分析miR-192的表达水平。上述实验单独重复3次。

1.2.9 Western blot 检测结肠相关蛋白表达 取适量结肠组织加入含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰上研磨后离心提取总蛋白。BCA 法进行蛋白定量，按照1∶4 向上清液中加入5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中加热变性10 min。取50 μg 的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳进行蛋白分离，采用湿转法将分离的蛋白转至PVDF 膜上，5%的脱脂牛奶于室温下封闭2 h 后，分别加入 Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗，4℃ 摇床孵育过夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶标记的二抗（1∶5 000）室温孵育 1 h，以 TBST 溶液清洗 3 次，5 min/次。最后均匀滴加ECL 发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照。Image J 软件测定条带灰度值，以目标蛋白与内参β-actin 的比值作为其相对含量。上述实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0 和GraphPad Prism 5.0方法进行统计分析，数据结果用表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett's 或Bonferroni's多重比较进行分析；显著性检验水准α=0.05，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-192 在各组小鼠结肠组织中的表达 RTPCR 结果显示，与 Control 组小鼠相比，DSS 组、NC组、miR-192组小鼠的结肠组织中miR-192均显著下降，而与DSS 组相比，miR-192 组小鼠结肠组织中的miR-192 表达显著升高，NC 组无显著性差异。这表明DSS 能够诱导小鼠结肠组织中miR-192 表达下调，而在小鼠体内注射过表达miR-192 慢病毒能明显缓解miR-192下降的趋势。见图1。

图1 各组小鼠结肠组织中miR-192的表达情况Fig.1 Expression of miR-192 in colon tissue of each group of mice

2.2 过表达miR-192 对DSS 诱导的小鼠肠道炎症影响 采用体重变化、DAI评分及结肠HE染色来评估小鼠肠道炎症，结果显示，从第4 天开始，DSS 组、NC 组、miR-192 组小鼠的体重较 Control 组显著减轻（P<0.01），而在第 6、7 天时 miR-192 组小鼠体重下降趋势较DSS 与NC 组明显缓解（P<0.05，图 2A）；DAI 评分显示，从第 2 天开始，DSS 组、NC 组、miR-192 组小鼠的DAI 评分较Control 组显著升高，而在第 5、6、7 天时 miR-192 组小鼠 DAI 分值较 DSS 与 NC组明显降低（图2B）。HE 染色结果显示，Control 组小鼠结肠黏膜上皮完整，腺体排列整齐，绒毛轮廓清晰；DSS 组、NC 组小鼠肠黏膜上皮明显受损，腺体结构紊乱或消失，黏膜下伴大量炎症细胞浸润，隐窝消失；miR-192 组小鼠结肠黏膜基本完整，部分上皮细胞脱落，腺体结构排列欠规则，伴少量炎症细胞浸润，肠黏膜损伤程度较DSS组与NC组明显减轻（图2C）。

图2 各组小鼠的体重、DAI变化及结肠病理改变Fig.2 Body weight，DAI changes and colon pathological changes of mice in each group

2.3 过表达miR-192 对DSS 诱导小鼠肠黏膜炎症因子表达水平的影响 ELISA 结果显示，与Control组小鼠相比，DSS 组、NC 组、miR-192 组小鼠的结肠组织中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10 表达均显著增加；与DSS 组相比，miR-192 组小鼠结肠黏膜IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达均明显减少，而IL-10表达却显著增加，NC组无显著性差异。见图3。

图3 各组小鼠的结肠黏膜炎症因子表达水平Fig.3 Expression levels of colonic mucosa inflammatory factors in each group of mice

2.4 过表达miR-192对小鼠结肠组织MDA、SOD表达水平的影响 MDA、SOD 活性检测结果显示，与Control 组小鼠相比，DSS 组、NC 组、miR-192 组小鼠的结肠组织中MDA水平显著升高，而SOD的活性明显降低；与DSS 组相比，miR-192 组小鼠结肠组织中MDA 水平明显降低，SOD 的活性显著增加，NC 组无显著性差异。见图4。

图4 各组小鼠结肠组织MDA、SOD的表达水平Fig.4 Expression levels of MDA and SOD in colon tissue of mice in each group

2.5 过表达miR-192 对肠道单核巨噬细胞极化的影响 流式细胞术结果表明，与Control 组小鼠相比，DSS 组、NC 组、miR-192 组小鼠 LPMCs 中 M1 型巨噬细胞所占比例显著增加，且DSS 组、NC 组小鼠LPMCs中M2型巨噬细胞明显减少，而miR-192组小鼠LPMCs 中M2 型巨噬细胞无明显变化；与DSS 组相比，miR-192组小鼠LPMCs中M1型巨噬细胞所占比例明显减少，但M2型巨噬细胞却显著增加，NC组无显著性差异。见图5。

图5 流式细胞术检测小鼠体内过表达miR-192后对巨噬细胞极化的影响Fig.5 Flow cytometric detection of effect of overexpres⁃sion of miR-192 on polarization of macrophages in mice

2.6 miR-192 靶向抑制 HO-1 的表达 miRNA 靶基因在线预测网站TargetScan 预测结果表明HO-1 基因的3'-UTR 存在能与miR-192 的结合位点，这提示HO-1 可能为miR-192 的目标靶基因。利用双荧光素酶基因报告实验进行验证，结果显示与转染mim‐ic-NC+HO-1-WT 的293T 细胞相比，转染miR-192 mimic+HO-1-WT 的细胞荧光素酶活性显著降低，而转染mimic-NC+HO-1-MUT 及miR-192 mimic+HO-1-MUT 的细胞荧光素酶活性无显著性差异，这证实HO-1 是miR-192 的目标靶基因，且其表达能够被miR-192所抑制。见图6。

图6 miR-192靶向调控HO-1表达Fig.6 miR-192 targets and regulates HO-1 expression

2.7 过表达 miR-192 对 LPMCs 中 Nrf-2/HO-1 信号通路表达的影响 Western blot 实验结果显示，与Control 组小鼠相比，DSS 组、miR-192 组、NC 组小鼠LPMCs 中，Nrf-2、HO-1 蛋白表达均显著增加；与DSS 组相比，miR-192 组小鼠 LPMCs 中 Nrf-2、HO-1蛋白表达明显增加，NC组无显著性差异。见图7。

图7 过表达miR-192 对LPMCs 中Nrf-2/HO-1 信号通路表达Fig.7 Overexpression of miR-192 affects expression of Nrf-2/HO-1 signaling pathways in LPMCs

3 讨论

UC作为炎症性肠病的一种，其具体发病机制未完全清楚，而近年来，我国UC 的发病率呈上升趋势，严重影响患者的生活质量。目前临床针对UC现有治疗方法的效果均不理想，UC的治疗依赖于对其机制的研究。

异常的先天性或适应性免疫反应促进UC 的进展，其中包括促炎因子（如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12等）的表达水平升高及抑炎因子（如IL-10）的表达水平降低［13-14］。此外，肠黏膜组织氧化-抗氧化系统的失衡也是导致UC 发生的重要原因。在正常情况下，机体内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）（如H2O2、超氧阴离子、NO 等）受超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化物酶和一些抗氧化分子的精确调控，使活性氧的生成与清除维持在动态平衡的状态下［15］。而当机体受到有害刺激时ROS 浓度急剧升高并超出抗氧化系统的调节代偿能力时就会导致氧化应激，刺激细胞生成多种伤害性物质作用于肠上皮细胞，引起上皮细胞的功能障碍，损伤肠黏膜屏障［16-17］。

miRNAs 作为长度约为20~25 个核苷酸组成的短链非编码RNA，近年来在肿瘤、心脑血管、内分泌代谢及病毒感染等多种疾病领域的作用已受到越来越多学者的关注［18］。而在炎症性肠病中，国内外多数学者发现UC 患者的肠黏膜组织存在异常表达的miRNAs谱，其中miR-192在多个研究的结果中均表现为异常降低的现象［4-5，19］。miR-192由13号染色体长臂所编码，研究发现其在不同的器官或组织中发挥着不同的作用，如在肾脏中，miR-192 能够调控TGF-β/Smad3 通路参与调控肾脏的纤维化［20］。在肺癌中，miR-192-5p 能够在姜黄素的作用下上调其表达，通过PI3K/AKT 信号通路抑制肺癌细胞的增殖并诱导其发生凋亡［21］。在本研究中通过DSS建立小鼠UC 模型发现，miR-192 在UC 小鼠的结肠黏膜组织中的表达异常降低，这与既往的研究结果相同。同时，通过慢病毒过表达小鼠肠道黏膜组织中miR-192 发现，miR-192 能够显著改善 UC 小鼠的体重下降、黏液脓血便等症状。结肠黏膜的HE 染色也证实，过表达miR-192能够减轻UC 小鼠结肠组织的病理损伤。此外，检测过表达miR-192对UC 小鼠结肠组织炎症因子的表达及氧化应激的影响，结果miR-192 能够显著降低结肠黏膜组织对促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌，上调抑炎因子IL-10的表达，同时增加 SOD 活性，减少 MDA 的产生。SOD 作为机体重要的抗氧化物酶，能够清除组织内过度释放的氧自由基。肠道黏膜组织的SOD 抗氧化活性功能减低可导致局部的自由基清除能力受限，加重UC病情的进展。而MDA则是由ROS诱发而产生不饱和脂肪酸，其常被作为氧化应激对组织损伤的标志［22］。为进一步明确miR-192发挥上述保护性作用的相关机制，应用生物信息学进行深入探究，miR‐NA靶基因预测结果表明，HO-1存在能够与miR-192结合的序列，随后双荧光素酶基因报告实验验证了两者的靶向调控关系。

HO-1是近年来发现的一种应激诱导蛋白，可由ROS 和炎症信号诱导产生，产生细胞内源性保护作用［23］。因而，HO-1的表达被认为是对抗炎症反应和氧化损伤的适应性细胞反应［24］。在体内HO-1 与Nrf2 形成Nrf2/HO-1 信号通路，通过调控体内的抗氧化应激反应。而近年来有研究发现Nrf2/HO-1能够调控巨噬细胞的分化参与多种病理生理过程［25］。巨噬细胞作为肠道黏膜的固有免疫细胞，能通过多种炎症因子调控结肠炎，特别是急性期结肠的进展。既往研究发现巨噬细胞在不同的刺激下可分为M1 型与M2 型巨噬细胞，而这两种类型在UC 的发生发展中起着相反的作用［26］。M1 型巨噬细胞主要通过 INF-γ、TNF-α 等信号诱导激活，分泌大量IL-1β、TNF-α 等促炎因子，损伤黏膜结构及功能，加剧UC 的进展。而M2 型巨噬细胞又称抗炎症巨噬细胞，其主要通过IL-4、IL-10 等诱导激活，稳定高水平表达 IL-10 以促进黏膜损伤的修复［2，27］。最近有研究证实，HO-1 通过促进IL-10 的表达激活巨噬细胞的 M2 型极化，并抑制促炎因子 IL-6、TNF-α 等表达［28-29］。本研究发现在UC 小鼠体内过表达miR-192同样能够通过Nrf2/HO-1信号通路调控结肠黏膜巨噬细胞向M2 型极化，这可能是miR-192 在UC 小鼠体内发挥上述肠黏膜保护功能的作用机制。

综上，本研究发现在DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中miR-192 可靶向调控Nrf2/HO-1 信号通路的表达，促进肠黏膜巨噬细胞M1 型极化，发挥抗炎、抗氧化作用，改善结肠炎症状从而发挥保护作用，为结肠炎的治疗提供了新的策略与方向。