绿原酸抑制糖酵解及脂肪酸代谢调控M1型巨噬细胞极化①

蓝春花 孟 玲 陈成英 蓝 利 王新航 常升搏小吉 陆彩玲 李习艺 唐 深

（广西医科大学基础医学院，南宁530021）

绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是一种含有咖啡酸和奎宁酸的多酚物质，存在于人类饮食的咖啡或绿茶中，它已被证明具有多种有益的生物学特性，包括抗菌作用、抗炎作用、抗氧化作用以及抗肿瘤活性［1-2］。已有文献报道 CGA 通过 NF-κB 抑制前列腺素E 和环氧合酶-2 的合成，并通过抑制JNK/AP-1活化而发挥抗炎作用［3］。其抗炎作用通过抑制NF-κB的激活，降低TNF-α和IL-6的基因表达［4］。同时CGA也可以减轻肝、肾等多个器官的缺血或再灌注损伤。

炎症是机体对损伤、感染和应激的先天免疫反应，它在促炎和抗炎细胞因子之间保持平衡［5］。过度促炎细胞因子的产生可能导致慢性炎症性疾病的发展。慢性炎症或过度炎症反应与非酒精性脂肪性肝炎、心肌梗死、糖尿病、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、感染性休克等有关［6-7］。巨噬细胞是主要的炎症和免疫细胞，在非特异性和特异性免疫反应中起着重要作用［5］。由于微环境中细胞因子的平衡，巨噬细胞可以分化为不同的活化状态，它被广泛归类为“经典激活”促炎M1 型巨噬细胞和“替代激活”抗炎M2型巨噬细胞［8］。而巨噬细胞在不同极化状态的代谢方式各异，M1 型的CD36 mRNA 表达水平增加可提高细胞内游离脂肪酸和氧化型低密度脂蛋白的摄取，细胞内脂质水平高于M2型［9］。促炎M1 型巨噬细胞主要依赖无氧糖酵解和磷酸戊糖途径为主要代谢方式，以便巨噬细胞应对高度增殖的细菌感染；而抗炎M2 型巨噬细胞则以氧化磷酸化和脂肪酸氧化为主［10］。研究发现，在ox-LDL 诱导的RAW264.7 细胞脂质积累的模型中，CGA 可激活SIRT1并调节胆固醇代谢相关因子ABCA1、SREBP2和 miR-33 的表达［11］。饮食补充 CGA 对 LPS 慢性输注所致的大鼠肝损伤有肝保护作用，主要机制是CGA 参与下调肝脏中糖酵解酶的活性，上调了氧化磷酸化的酶的活性，导致能量代谢从糖酵解向线粒体氧化磷酸化的转变［12］。文献报道CGA 抑制NF-κB 或 JNK/AP-1 活化而发挥抗炎作用，但 CGA是否通过调节巨噬细胞糖酵解水平和脂肪酸代谢水平来调控巨噬细胞炎症极化尚不完全清楚。在本研究中，以THP-1细胞（人急性单核细胞白血病细胞系）构建体外M1型巨噬细胞模型，探讨了CGA 是否能通过调节巨噬细胞糖酵解水平和脂肪酸代谢水平，从而影响M1 型巨噬细胞极化相关标志物的表达，调控M1巨噬细胞的极化。

1 材料与方法

1.1 材料 人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。绿原酸（chlorogenic acid，Sigma），佛波酯（phorbol myristate acetate，美国Sigma公司）；IFN-γ（北京Sino-Biological 公司）；青霉素、链霉素、LPS、糖酵解相关酶（HK、PK、LDH）试剂盒（索莱宝生物技术公司）；RPMI1640 培养液、胎牛血清（美国Gibco 公司）；RNA 逆转录相关试剂、TRIzo（l日本TaKaRa 公司）；SYBR®Green Master（美国Roche 公司）；引物由Invi‐trogen 公司合成；StepOne 荧光定量 PCR 仪、Multi‐skan Go 全波长多功能酶标仪、CO2细胞培养箱均为美国Thermo Fisher Scientific 产品。

1.2 方法

1.2.1 THP-1 细胞培养 THP-1 细胞培养于含10% 的胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素的RPMI1640 培养液中，37℃5%CO2培养箱中静置培养。

1.2.2 THP-1 细胞分化及分组 THP-1 细胞以1.0×106个/孔接种于6 孔板，经100 nmo/lL PMA 刺激24 h 活化为M0 型巨噬细胞，在此基础上将实验分为3 组。对照组（M0 型巨噬细胞）、M1 型巨噬细胞组（用 10 ng/ml LPS 和 20 ng/ml IFN-γ 处理 M0 巨噬细胞48 h）、CGA 处理组（用 50 μg/ml、100 μg/ml CGA 分别与 10 ng/ml LPS、20 ng/ml IFN-γ 共处理48 h），将细胞置于37℃5%CO2培养箱中培养，分化为M1型巨噬细胞。

1.2.3 倒置显微镜观察细胞形态和Image J 软件进行细胞形态学分析和计数 细胞分组同1.2.2，各分组细胞极化完成后，倒置显微镜观察各组的细胞形态学改变并摄取实验组3张细胞密度相近的细胞图片，通过Image J 软件自动计数各组内3 张细胞图片中的总细胞数和长梭形、不规则形细胞数，最终算出长梭形和不规则形细胞数占总细胞数的百分比。

1.2.4 实时荧光定量PCR 检测M1 型巨噬细胞表面标志物IL-6、TNF-α、COX-2、CXCL-10 和脂肪酸代谢相关标志物氧化物PPAR-γ、SREBP-1的mRNA 水平 THP-1 细胞按 1.0×106个/孔接种于 6 孔板，同1.2.2 实验分组处理THP-1 细胞。分化完成后，各组实验孔用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗1次，每孔加入1 ml TRIzol 试剂，按照试剂说明书提取总mRNA，以 500 ng 为总 RNA 逆转录为 cDNA，95℃预变性10 min，（95℃ 变性30 s，60℃ 退火10 s）×40 个循环，以 β-actin 为内参，采用 2-ΔΔCt法计算相对基因表达量。引物见表1。

表1 引物名称和序列Tab.1 Primer names and sequences

1.2.5 微量法试剂盒检测巨噬细胞内糖酵解相关 酶活性 HK（PK、LDH）提取：THP-1 细胞以1.0×106个/孔接种于6 孔板，同1.2.2 实验分组处理细胞，先弃掉上清，用PBS 洗2 次，每孔加入200 μl HK（PK、LDH）提取液，用无菌的细胞刮子将细胞收集于1.5 ml EP 管内，在冰浴条件下超声裂解细胞，4℃8 000 g离心10 min，取上清置于冰上待测。

按照试剂说明步骤加入试剂和待测样本：振荡混匀，酶标仪在波长340 nm 测定各组20 s 时的吸光值 A1 和 320 s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1，根据公式计算各组HK 的活性；再在波长340 nm 测定各组20 s 时的吸光值A1 和200 s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2，根据公式计算各组PK 的活性；450 nm 波长下测定实验组和对照组吸光度A，计算ΔA=测定管A-对照管A，根据公式计算LDH活性。

1.3 统计学处理 所有实验数据均采用SPSS17.0统计软件进行分析，结果以表示，独立样本t检验，单因素方差分析及LSD 两两比较，每组实验独立重复3次以上，P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察CGA 处理后巨噬细胞形态学改变 THP-1 细胞经PMA 刺激活化为M0 巨噬细胞，细胞逐渐扁平贴壁呈煎蛋样，由光亮变成灰色，形态呈类圆形或不规则形；M0 巨噬细胞极化M1 型巨噬细胞后，细胞伸出伪足，呈梭形和不规则形；CGA 处理组与M1 型组相比，梭形细胞和不规则细胞占比减少，随着CGA 浓度增加这种形态变化越明显。细胞形态学变化结果提示CGA 处理后能抑制M1型巨噬细胞长梭形和伪足的形成（图1）。

图1 巨噬细胞分化形态学变化Fig.1 Morphological of macrophage polarization

2.2 CGA 对M1 型巨噬细胞极化相关基因TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 mRNA 表达水平的影响 M1型与 M0 型相比，TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 这4 种极化相关标志物mRNA 表达均升高（P<0.05）；加入 CGA 处理后，与 M1 型极化组相比，TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 mRNA 表达均降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果提示CGA 可降低M1 型巨噬细胞极化相关基因标志物mRNA 表达水平（图2）。

图2 CGA对M1型巨噬细胞极化相关基因mRNA表达影响Fig.2 Effects of CGA on gene mRNA expression of M1 macrophage

2.3 CGA 对 M1 巨 噬 细 胞 PPAR-γ、SREBP-1 的mRNA 表达水平的影响 M1 型与M0 型相比，PPAR-γ、SREBP-1 mRNA 表达升高；加入 CGA 处理后，与 M1 型极化组相比，PPAR-γ、SREBP-1 mRNA表达均降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果提示CGA 可降低M1 型巨噬细胞PPAR-γ、SREBP-1 mRNA的表达水平（图3）。

图3 CGA 对 M1 型 巨 噬 细 胞 PPAR-γ、SREBP-1 基 因mRNA表达影响Fig.3 Effects of CGA on expressions of PPAR-γ and SREBP-1 genes in mRNA M1 macrophages

2.4 CGA 对M1型巨噬细胞糖酵解相关酶HK、PK、LDH 活性的影响 M0 型诱导极化为 M1 型，HK、PK、LDH酶活性均增加（P<0.05），CGA处理组与M1型极化组相比，HK、PK、LDH 活性降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果提示，CGA 可以降低M1型巨噬细胞的糖酵解水平（图4）。

图4 CGA对M1型巨噬细胞糖酵解相关酶活性的影响Fig.4 Effects of CGA on glycolytic enzyme activity in M1 macrophage

3 讨论

巨噬细胞是组织中的天然免疫细胞，作为介导炎症的主要吞噬细胞，负责清除机体损伤组织和细胞碎片以及入侵的病原体，并参与炎症损伤后的组织修复。在炎症急性期，“经典激活”促炎M1 型巨噬细胞诱导炎症反应，通过释放促炎介质，包括细胞因子、趋化因子、活性氧等，诱导激活多种抗菌机制，有助于杀灭病原体和维持正常炎症反应［13］。研究表明CGA 具有抗炎作用，促进伤口愈合，减轻肝缺血再灌注所致的肝损伤。CGA 通过抑制NF-κB信号通路激活从而下调CCl4诱导的大鼠肝脏炎症和纤维化模型中血清IL-1β、TNF-α 和IL-6细胞炎症因子水平［14］。

在肾缺血再灌注损伤的小鼠模型中，炎症介质因子表达量增加，巨噬细胞数量增加，CGA通过降低TLR-4 信号通路相关蛋白（NF-κB、TNF-α 和MCP-1）的mRNA 表达，减少巨噬细胞的数量，从而减轻炎症反应［15］。本研究中CGA 处理组的梭形细胞和不规则细胞数量减少，类圆形细胞增多，细胞伸出伪足减少，M1 型巨噬细胞极化标志物IL-6、TNF-α、CXCL-10、COX-2的mRNA 表达量下降，表明CGA 能降低M1 型巨噬细胞促炎症细胞因子的表达，并抑制M1 型巨噬细胞贴壁展开和伪足形成。文献报道单独LPS处理RAW 264.7细胞可显著提高细胞IL-6、TNF-α 蛋白表达水平和细胞上清液中 IL-6、TNF-α浓度，而CGA 与LPS 共孵育时，则表现出明显的降低［16］，与本研究结果相似。

巨噬细胞在极化时会显著改变其代谢途径，在LPS，Th1细胞因子或IL-12的刺激下，其代谢向无氧糖酵解途径的转变，LPS和IFN-γ会诱导巨噬细胞葡萄糖摄取，抑制脂肪酸摄取和氧化［17-19］。SREBPs 是调控脂肪酸和胆固醇生物合成的关键转录因子，LPS 和炎症细胞因子可以诱导巨噬细胞的SREBP-1产生活性；相反，SREBP-1c 缺乏的小鼠巨噬细胞在LPS 刺激后 IL-1β 分泌降低［20-21］。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是属于类固醇/甲状腺激素受体超家族的核受体，调节脂质代谢相关基因的表达，PPAR-γ 可通过激活促进脂质摄取和脂肪生成的基因来调节脂肪酸的储存。PPAR-γ 的过度表达可导致脂肪组织和肝脏中的脂质积累［22］。本研究结果显示，由M0 型分化为M1 型巨噬细胞后，糖酵解HK、PK、LDH 活性均增加，脂肪酸合成相关基因PPAR-γ、SREBP-1 的 mRNA 水平增加，提示细胞内糖酵解和脂肪酸代谢增加。研究表明，CGA 通过AKTPH结构域激活AKT/GSK3β/FOXO1信号，过调节糖异生和糖酵解酶，如葡萄糖6-磷酸酶（G6P）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）的基因表达，在肝脏维持葡萄糖稳态中发挥作用。CGA 也可降低小鼠肝脏组织脂肪酸合成酶和PPAR-γ2 的基因表达水平来降低脂肪酸的合成，起到保护肝脏的作用［23-24］。本研究结果表明 CGA 可以降低 M1 型巨噬细胞 HK、PK、LDH 活性，下调 PPAR-γ、SREBP-1 的mRNA 表达水平，提示CGA 处理后M1 型巨噬细胞中糖酵解和脂肪酸水平被抑制。这可能是CGA 参与负调控M1型巨噬细胞炎症极化的机制之一。

综上所述，CGA 可能通过抑制糖酵解和脂肪酸代谢水平，降低M1 型巨噬细胞促炎症细胞因子的mRNA表达，负调控M1型巨噬细胞炎症极化。本研究为探索CGA 在巨噬细胞相关炎症性疾病的免疫营养治疗提供新思路。