miR-145-5p 通过靶向DUSP6 抑制LPS 诱导的血管内皮细胞氧化损伤和炎症①

王鸿利 何 琴 刘 帆 袁 霞 张 勤

（四川省医学科学院·四川省人民医院老年内五科，成都610072）

动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病，以内皮细胞（endothelial cells，EC）为初始靶点，导致内皮功能障碍从而引发炎症［1-3］。有研究表明双特异性磷酸酶 6（dual-specificity phosphatase 6，DUSP6）参与炎症相关生理过程并促进炎症反应，而抑制DUSP6 过表达是有效的消炎疗法［4-6］。microRNA（miRNA）是一种内源性非编码RNA，具有约22 个核苷酸，通过与mRNA 的3'非翻译区（3'UTR）结合来抑制基因的翻译或诱导mRNA 切割，从而调节基因表达［7］。miRNA 已被证明参与多种炎症反应的调节并且部分RNA 可参与调节与动脉粥样硬化的发生和发展有关的血管壁炎症［8-10］。研究发现miR-145-5p 可通过多种途径缓解体内炎症反应，但其对动脉粥样硬化发生过程的调节还未见报道［11-12］。脂多糖（lipo‐polysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，可激活血管内皮细胞，引起白细胞渗透进入血管壁，并增加血管通透性，被认为是炎症反应的有效诱导剂［13］。在本研究中，以LPS 诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）为炎症损伤模型，探讨了miR-145-5p对血管EC 氧化损伤和炎症的调节作用及相关的分子机制，旨在为动脉粥样硬化引起的EC 损伤治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料 HUVECs 来自美国ATCC。LPS、高葡萄糖DMEM 培养基、胎牛血清均购自Sigma公司；链霉素和青霉素购自HyClone 公司；pcDNA、miR‐NC、pcDNA-DUSP6、miR-145-5p mimic、pMIR 报告质粒载体及试验所用序列购自RiboBio 公司；Lipo‐fectamine2000 试剂购自Invitrogen 公司；试验所用抗体均购自上海艾博抗生物科技有限公司；BCA 试剂盒，iNOS 检测试剂盒和IL-10 检测试剂盒购自合肥莱尔生物科技有限公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；组织蛋白提取试剂盒购自Foregene公司；逆转录酶、TRIzol 试剂盒、荧光素酶检测试剂盒购自Pro‐mega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HUVECs 细胞用含有10%胎牛血清的高糖培养基培养（含链霉素、青霉素双抗），在37℃、5%CO2培养箱中培养至生长约80%后传代，取4~5代生长状态良好的细胞用于后续试验。

1.2.2 细胞转染及细胞模型建立 将HUVECs 细胞以 5×105个/ml 的密度接种于 12 孔板中培育至约80%汇合进行转染，分别进行pcDNA、miR-NC、pcD‐NA-DUSP6、miR-145-5p mimic转染和pcDNA-DUSP6与miR-145-5p mimic共转染。将DUSP6 mRNA 的编码区克隆到pcDNA3.1（+）载体中。所有细胞转染程序均使用Lipofectamine2000进行。

1.2.3 体外细胞模型建立 转染成功后收获细胞，非Control组细胞进行LPS 诱导（2 h）以建立炎症损伤模型。当天诱导试验完成后吸去细胞培养基随即加入新鲜的无血清DMEM 培养基后孵育12 h。实验分组：Control 组、LPS 组、LPS+mimic 组、LPS+DUSP6 组和LPS+mimic+DUSP6 组。培养结束后分别收集5组细胞培养上清液置-80℃保存。

1.2.4 RT-PCR 检测方法 TRIzol 试剂盒抽提总mRNA，使用逆转录酶先合成cDNA，然后再进行PCR 扩增，反应条件：94℃ 先变性 3 min，然后 94℃1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，36 个循环，最后 72℃7 min。RT-PCR 产物经电泳后用计算机图像分析仪扫描，经凝胶图像分析系统，对产物的电泳条带进行灰度分析，计算相对mRNA 水平表达量。引物序列miR-145-5p：F 5'-CAGTCTTGTCCAGTTTTCCCAG-3'；R 5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTGTC-3'。DUSP6：F 5'-CAGTGGTGCTCTACGACGAG-3'；R 5'-GCAATGCAGGGAGAACTCGGC-3'。

1.2.5 双重荧光素酶实验 TargetScan 软件显示DUSP6 是 miR-145-5p 的 靶 标 之 一 。 DUSP6 野 生 型（DUSP6-WT）片段（包含潜在的结合位点）和相应DUSP6 突变型（DUSP6-MUT）片段被插入miR-145-5p 的pMIR 报告质粒载体，以产生DUSP6 萤光素酶报告基因构建体。然后，使用Lipofectamine 2000 试剂将载体和miR-145-5p 模拟物共转染到HUVECs细胞中［14］。转染24 h 后，使用荧光素酶检测试剂盒测定细胞。记录Rluc/Luc。

1.2.6 试剂盒检测氧化应激 细胞样取上清液，按照SOD 检测试剂盒和MDA 检测试剂盒的操作要求进行实验操作与结果分析。

1.2.7 ELISA 法检测细胞上清液中炎症因子 细胞样取上清液，按照iNOS 检测试剂盒和IL-10 检测试剂盒的操作要求进行实验操作与结果分析。

1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 每组细胞样品各取一份，用AnnexinV/PI 双染色流式细胞术检测细胞凋亡，并计算细胞凋亡率。

1.2.9 Western blot 按照细胞蛋白提取试剂盒说明进行蛋白提取，用BCA 法测定蛋白浓度，将制备好的蛋白样品加入10%的凝胶中电泳，转膜，取膜，将其加入封闭液中，保持20 min，用蒸馏水将一步法试剂盒中的10×洗液稀释成1×洗液；取二抗HRP 至4 ml 离心管中，再取一抗与二抗混匀，室温孵育5 min，加入一步法抗体稀释液。其中，一抗浓度Bax（1∶1 000），Bcl-2（1∶500），DUSP6（1∶1 000），一抗内参Actin浓度（1∶1 000），二抗内参Actin浓度（1∶500），去抗体混合液，用洗液漂洗3次，5 ml×5 min。ECL 显色曝光，采用Image J 分析内参Actin 和目标条带的灰度值，目标条带蛋白水平=目标条带的灰度值/Actin 的灰度值。每组实验重复3 次，每次设3 个复孔。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件分析实验数据，实验数据用表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-145-5p 靶 向 DUSP6 HUVECs 细 胞 转 染pcDNA-DUSP6 后结果显示，与 Control 组相比，pcD‐NA-DUSP6转染组中DUSP6的相对mRNA 水平显著升高（图1A，P<0.05），而miR-145-5p 相对mRNA 水平显著降低（图1B，P<0.05），表明DUSP6 过表达HUVECs 细胞构建成功。HUVECs 细胞转染miR-145-5p mimic 后结果显示，与 Control 组相比，miR-145-5p mimic 转染组中 miR-145-5p 相对 mRNA 水平显著升高（图1C，P<0.05），这表明miR-145-5p 成功转染了HUVECs 细胞，并构建了稳定的miR-145-5p过表达HUVECs 细胞系。TargetScan 软件预测miR-145-5p 可以直接结合到DUSP6 基因的3'-UTR 区（图1D）。双重荧光素酶报告基因检测结果表明，miR-145-5p 可以显著抑制DUSP6 3'-UTR-wt 载体的荧光强度，但不能抑制DUSP6 3'-UTR-mut载体的荧光强度（图1E，P<0.05）。结果表明，miR-145-5p 和DUSP6具有良好的靶向关系。

图1 miR-145-5p靶向DUSP6Fig.1 miR-145-5p targets DUSP6

2.2 miR-145-5p 过表达下调HUVECs 细胞中DUSP6 的表达水平 如图 2A 所示，与 Control 组相比，LPS 组中miR-145-5p 表达水平显著降低（P<0.05）。与 LPS 组相比，LPS+mimic 组中 miR-145-5p表达水平显著升高，而LPS+DUSP6 组中miR-145-5p表达水平显著降低（P<0.05）。与LPS+DUSP6 组相比，LPS+mimic+DUSP6 组中 miR-145-5p 表达水平显著提升（P<0.05）。如图2B 所示，与Control 组相比，LPS 组中 DUSP6 相对 mRNA 水平显著升高（P<0.05）。与 LPS 组相比，LPS+mimic 组中 DUSP6 相对mRNA 水平显著降低，而 LPS+DUSP6 组中 DUSP6 相对mRNA 水平显著升高（P<0.05）。与LPS+DUSP6组相比，LPS+mimic+DUSP6 组中 DUSP6 相对 mRNA水平显著降低（P<0.05）。如图2C 所示，与Control组相比，LPS 组中DUSP6 相对蛋白水平显著升高（P<0.05）。与 LPS 组相比，LPS+mimic 组中 DUSP6相对蛋白水平显著降低，而LPS+DUSP6组中DUSP6相对mRNA 水平显著升高（P<0.05）。与LPS+DUSP6 组相比，LPS+mimic+DUSP6 组中 DUSP6 相对蛋白水平显著降低（P<0.05）。表明miR-145-5p 过表达可下调HUVECs细胞中DUSP6的表达水平。

图2 5组细胞中miR-145-5p和DUSP6的表达水平Fig.2 Expression levels of miR-145-5p and DUSP6 in 5 groups of cells

2.3 miR-145-5p 过表达可抑制HUVECs 细胞凋亡 如图 3A 所示，与 Control 组相比，LPS 组中细胞凋亡率显著提升（P<0.05）。与LPS 组相比，LPS+mimic 组中细胞凋亡率显著下降，而LPS+DUSP6 组中细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。与LPS+DUSP6组相比，LPS+mimic+DUSP6 组中细胞凋亡率显著下降（P<0.05）。如图 3B 所示，与Control 组相比，LPS组中Bax/Bcl-2 比率显著提升（P<0.05）。与LPS 组相比，LPS+mimic 组中 Bax/Bcl-2 比率显著下降，而LPS+DUSP6 组 中 Bax/Bcl-2 比 率 显 著 升 高（P<0.05）。与 LPS+DUSP6 组相比，LPS+mimic+DUSP6组中Bax/Bcl-2 比率显著下降（P<0.05）。表明miR-145-5p过表达可抑制HUVECs细胞凋亡。

图3 5组细胞凋亡情况Fig.3 Apoptosis of 5 groups cells

2.4 miR-145-5p 过表达可缓解HUVECs 细胞氧化应激 如图 4A 所示，与 Control 组相比，LPS 组中SOD 含量显著降低（P<0.05）。与LPS 组相比，LPS+mimic 组中 SOD 含量显著上升，而 LPS+DUSP6 组中SOD含量则显著降低（P<0.05）。与LPS+DUSP6组相比，LPS+mimic+DUSP6 组中SOD 含量显著上升（P<0.05）。如图 4B 所示，与 Control 组相比，LPS 组中MDA含量显著上升（P<0.05）。与LPS组相比，LPS+mimic 组中 MDA 含量显著下降，而 LPS+DUSP6 组中MDA 含量则显著升高（P<0.05）。与LPS+DUSP6 组相比，LPS+mimic+DUSP6 组中MDA 含量显著降低（P<0.05）。表明miR-145-5p过表达可缓解HUVECs细胞氧化应激。

图4 5组细胞氧化应激情况Fig.4 Oxidative stress of 5 groups cells

2.5 miR-145-5p 过表达可缓解HUVECs 细胞炎症损伤 RT-PCR 检测结果显示，与Control 组相比，LPS 组中 iNOS 与 IL-10 相对 mRNA 水平显著升高（P<0.05）。与LPS 组相比，LPS+mimic 组中 iNOS 相对mRNA水平显著降低，而IL-10相对mRNA水平显著升高（P<0.05）。与LPS 组相比，LPS+DUSP6 组中iNOS 相对 mRNA 水平显著升高（P<0.05），而 IL-10相对mRNA水平无显著性变化。与LPS+DUSP6组相比，LPS+mimic+DUSP6组中iNOS相对mRNA水平显著降低，而IL-10相对mRNA水平显著升高（P<0.05）。见图5A。

ELISA 检测结果显示，与 Control 组相比，LPS 组中iNOS 与IL-10 含量均显著升高（P<0.05）。与LPS组相比，LPS+mimic 组中iNOS 含量显著降低，而IL-10 含量显著升高（P<0.05）。与LPS 组相比，LPS+DUSP6 组中iNOS 含量显著升高（P<0.05），而 IL-10含量无显著性变化。与LPS+DUSP6 组相比，LPS+mimic+DUSP6 组中 iNOS 含量显著降低，而 IL-10 含量显著升高（P<0.05）。见图5B。表明miR-145-5p过表达可缓解HUVECs细胞炎症损伤。

图5 5组细胞中炎症相关因子含量Fig.5 Contents of inflammation related factors in 5 groups cells

3 讨论

EC 功能障碍是引起多种心内科疾病的主要原因，尤其是老年疾病，如动脉粥样硬化、类风湿关节炎、糖尿病等［15-17］。而内皮功能障碍的主要特征是炎症损伤。炎症是由有害刺激（如感染和坏死组织）引起的基本的先天免疫反应，通常以促炎细胞因子的产生为特征［18］。研究发现炎症与人类慢性疾病的发病机理密切相关，并且炎症通常伴随氧化应激等不良反应。因此，炎症过程的控制在预防相关疾病过程中起着至关重要的作用。

在这项研究中，以LPS诱导的HUVEC为炎症损伤模型，探讨了miR-145-5p 对氧化损伤和炎症的调节作用及相关的分子机制。实验结果显示，DUSP6在LPS诱导的HUVECs 细胞炎症模型中高表达。这一结果与 ZHANG 等［6］的研究结果相似，他们发现LPS处理巨噬细胞会上调DUSP6水平进而触发炎症细胞因子的产生，而DUSP6 抑制剂则减轻了LPS 诱导的小鼠巨噬细胞的炎症反应［7］。在本研究中miR-145-5p 与DUSP6 抑制剂有着异曲同工的作用。并发现miR-145-5p 可以显著抑制DUSP6 3'-UTR-wt 载体的荧光强度，但不能抑制DUSP6 3'-UTR-mut载体的荧光强度，预示着DUSP6 是miR-145-5p 调控的潜在靶标。进一步的实验结果与预期相似，过表达的miR-145-5p 下调了 DUSP6 的表达水平，同时，miR-145-5p 过表达降低了iNOS 相对mRNA 水平并使IL-10 含量显著升高。预示miR-145-5p 可以通过下调DUSP6水平抑制LPS诱导的HUVECs细胞的炎症损伤。GU 等［19］研究发现，TUG1 抑制剂可以通过激活miR-145-5p/DUSP6 轴来缓解香烟烟雾引起的慢性阻塞性肺疾病炎症和对气道重塑的抑制作用。炎症损伤过程中通常伴随较为强烈的氧化应激反应。SOD 和MDA 是较为常见的氧化应激标志物。在本研究中LPS 组细胞中SOD 含量显著降低而MDA 含量显著上升。miR-145-5p 过表达显著提高了HUVECs细胞中SOD含量并降低了MDA含量。

过度炎症反应与氧化应激损伤会诱发细胞凋亡。研究发现多种miRNAs 可以介导细胞凋亡，miR-145-5p 亦包含在内［12，20］。在本研究中 miR-145-5p 过表达可以降低HUVECs 细胞的Bax/Bcl-2 比率，预示miR-145-5p具有抑制细胞凋亡的作用。

预防和控制炎症反应及其相关反应的发生是预防EC 功能障碍的有效手段，对老年性疾病，如动脉粥样硬化，心血管疾病等都有很好的作用。在本研究中miR-145-5p 过表达可以通过下调DUSP6 水平缓解HUVECs细胞氧化应激与炎症损伤并抑制细胞凋亡。这预示DUSP6 是控制EC 炎症障碍的潜在治疗靶标，而运用miR-145-5p 调节是有前途的治疗策略。