咪喹莫特对MRL/ lpr狼疮小鼠Th2细胞和IgG1+浆细胞的影响①

沈春秀 段相国 吴丽华 张晓羽 兰亚如 苏春霞 （宁夏医科大学基础医学院，银川750004）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种由于自身抗体产生过多，形成免疫复合物沉积于组织器官而造成机体损伤的自身免疫性疾病，目前致病原因尚不明确［1-4］。多项研究表明，细胞因子失调可能是SLE 发病机制的重要组成部分，其中，Th2 细胞因子起重要作用［5-6］。细胞因子IL-4 被认为是Th2 细胞的主要功能性细胞因子，不仅促进 Th0 向Th2 分化，增加Th2 细胞的数量，而且通过介导体液免疫，促进B 细胞分化、成熟和增殖，诱导抗体类别向IgG1转化［7-10］。研究显示，SLE患者体内Th2细胞比例和功能性细胞因子IL-4的分泌水平明显升高。因此，有效降低SLE 患者体内Th2 细胞比例和功能细胞因子IL-4的分泌在寻求治疗SLE的药物方面尤为重要。

咪喹莫特（imiquimod，IMQ）是一种新型的TLR7激动剂，近期有研究发现，IMQ可通过诱导细胞内钙离子通路，激活活化转录因子负向调控共刺激信号，诱导CD4+T细胞几乎完全“失能”，从而抑制细胞因子 IL-4、IL-17、IL-21 等的分泌［11］。本文通过研究IMQ对MRL/lpr狼疮小鼠Th2细胞和IgG1+浆细胞的影响，初步探讨其下调IgG1+浆细胞比例的可能原因，为IMQ 成为治疗SLE 的靶向药物提供新的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级健康MRL/lpr 狼疮小鼠（BALB/c 背景）及 BALB/c 小鼠各 15 只，6~8 周龄，体重18~22 g，均购自上海斯莱克股份有限公司（动物合格证号：SCXK（沪）2017-0005）。小鼠均饲养于宁夏医科大学实验动物中心，严格按照小鼠饲养规则喂养，温度为25℃，湿度为50%，光照时间为8：00~20：00，饮用蒸馏水，饲养期间保持饲养房间整洁、通风，定时清理鼠笼。实验动物及饲养条件符合《实验动物管理条例》要求。小鼠适应性饲养8周后用于后续实验。

1.1.2 主要试剂 咪喹莫特（纯度>99%）购自MedChem Express；地塞米松（国药准字H42020020）购自湖北天药股份有限公司。采用9 g/L 生理盐水配制咪喹莫特和地塞米松注射液。小鼠外周血淋巴细胞分离液购自康宁；小鼠CD4 T 淋巴细胞分选试剂盒、流式抗体anti-CD19-FITC、anti-IgG1-PE、anti-IL-4-PE 均购自 BD 公司；RPMI1640 培养基购自Gibco 公司；胎牛血清（fetal bottles bovine，FBS）、青霉素-链霉素、转录因子染色液购自eBioscience；佛波酯、离子霉素钙盐、莫能霉素均购自Solarbio。

1.1.3 主要仪器设备 Z383 型水平离心机，德国公司；BD FACS CelestaTM流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 体内实验分组及给药 15 只BALB/c 正常小鼠和15 只MRL/lpr 狼疮小鼠均随机分为3 组：生理盐水组（Veh）、0.05 mg/kg 咪喹莫特组（IMQ）、按照文献［12］设置1 mg/kg 地塞米松组（DXM），5 只/组；各组小鼠按以上剂量每天腹腔注射给药，连续干预4周。

1.2.2 磁珠分选CD4+T 细胞 连续干预4 周后，分别按颈椎脱臼方法处死小鼠，无菌取脾脏，充分研磨，制成脾细胞悬液，通过淋巴细胞分离液分离单个核细胞，按照说明书磁珠分选CD4+T细胞，台盼蓝染色法计数活的CD4+T细胞。

1.2.3 流式细胞术检测小鼠脾脏中Th2 细胞比例 分选出的CD4+T 细胞，以1×106个/孔培养于含2%FBS，100 U/（μg·ml）青霉素-链霉素，50 ng/ml PMA，250 ng/ml离子霉素钙盐及莫能霉素1.39 μg/ml的RPMI1640 培养基中，37℃培养箱培养4 h；适量PBS 重悬细胞，1 500/rmin 离心 5 min，弃上清；加入200 μl 破膜液，常温避光孵育 30 min 后加入 350 μl 1×Buffer 重悬后，1 500/rmin 离心 5 min，弃上清；100 μl PBS 重悬细胞，加入 1 μl IL-4-PE ，4℃ 孵育30 min，适量PBS 洗涤细胞，流式细胞仪检测Th2 细胞比例［CD4+IL-4+T细胞（%）］。

1.2.4 流式细胞术检测小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例 分离出的单个核细胞，以1×106个/管加入100 μl PBS重悬细胞，加入0.5 μl CD19-FITC、0.5 μl IgG1-PE 4℃孵育30 min，适量PBS洗涤细胞，流式细胞术检测IgG1+浆细胞比例［CD19+IgG1+B细胞（%）］。

1.3 统计学分析 统计学处理采用SPSS22.0软件进行分析，计量资料以表示；不同样本间比较，采用单因素方差分析法，采用Pearson 作相关性分析，检验水平为0.05。流式分析采用Flowjo VX.0.7软件。统计学作图采用GraphPad Prism7软件。

2 结果

2.1 IMQ对BALB/c小鼠脾脏中Th2细胞比例的影响 连续干预4 周后，Veh 组BALB/c 小鼠脾脏中Th2 细胞比例为（6.03±0.05）%，IMQ 组 BALB/c 小鼠脾脏中 Th2 细胞比例为（5.53±0.08）%，DXM 组BALB/c小鼠脾脏中Th2细胞比例为（6.24±0.19）%。与 Veh 组相比，IMQ 组 BALB/c 小鼠脾脏中 Th2 细胞比例明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），DXM组BALB/c小鼠脾脏中Th2细胞比例有升高趋势，差异无统计学意义（P=0.21）。与DXM 组相比，IMQ 组BALB/c小鼠脾脏中Th2细胞比例明显降低，差异有统计学差异（P<0.01）。见图1。

图1 IMQ对BALB/c小鼠脾脏中Th2细胞比例的影响Fig.1 Effect of IMQ on proportion of Th2 cells in spleen of BALB/c mice

2.2 IMQ 对BALB/c 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例的影响 连续干预4 周后，Veh 组BALB/c 小鼠脾脏中 IgG1+浆 细 胞 比 例 为（1.83±0.04）% ，IMQ 组BALB/c 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例为（1.73±0.03）%，DXM 组 BALB/c 小鼠脾脏中 IgG1+浆细胞比例为（2.45±0.08）%。与 Veh 组相比，IMQ 组BALB/c 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；DXM 松组BALB/c 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞例明显升高，差异有统计学意义（P<0.001）。与 DXM 组相比，IMQ 组 BALB/c 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显降低，差异有统计学差异（P<0.001）。见图2。

图2 IMQ对BALB/c小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例的影响Fig.2 Effects of IMQ on proportion of IgG1+plasma cells in spleen of BALB/c mice

2.3 IMQ 对MRL/lpr 小鼠脾脏中Th2 细胞比例的影响 连续干预4 周后，Veh 组BALB/c 小鼠脾脏中Th2 细胞比例为（6.03±0.05）%，Veh 组 MRL/lpr 小鼠脾脏中 Th2 细胞比例为（6.39±0.09）%，IMQ 组MRL/lpr 小 鼠 脾 脏 中 Th2 细 胞 比 例 为（6.04±0.07）%，DXM 组MRL/lpr 小鼠脾脏中Th2 细胞比例为（6.87±0.15）%。与BALB/c 小鼠相比，MRL/lpr小鼠脾脏中Th2 细胞比例明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与Veh 组相比，IMQ 组MRL/lpr 小鼠脾脏中Th2 细胞比例明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；DXM 组MRL/lpr 小鼠脾脏中 Th2 细胞比例明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与DXM 组相比，IMQ 组 MRL/lpr 小鼠脾脏中 Th2 细胞比例明显降低，差异有统计学差异（P<0.001）。见图3。

图3 IMQ对MRL/lpr小鼠脾脏中Th2细胞比例的影响Fig.3 Effect of IMQ on proportion of Th2 cells in spleen of MRL/lpr mice

2.4 IMQ 对MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例的影响 连续干预4 周后，Veh 组BALB/c 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例为（1.83±0.04）%，Veh 组MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例为（3.81±0.27）%，IMQ 组MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例为（2.39±0.14）%，DXM 组MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例为（3.91±0.33）%。与BALB/c 小鼠相比，MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显升高，差异有统计学意义（P<0.001）。与Veh 组相比，IMQ 组MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；DXM 组MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例有升高趋势，差异无统计学意义（P=0.77）。与DXM 组相比，IMQ 组MRL/lpr 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显降低，差异有统计学差异（P<0.001）。见图4。

图4 IMQ对MRL/lpr小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例的影响Fig.4 Effects of IMQ on proportion of IgG1+plasma cells in spleen of MRL/lpr mice

2.5 MRL/lpr 狼疮小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例与Th2 细胞因子IL-4 表达的相关性分析 由上述结果可知，IMQ 可下调Th2 细胞（细胞因子IL-4）和IgG1+浆细胞比例，因此对细胞因子IL-4与IgG1+浆细胞的比例进行了相关性分析，结果显示，MRL/lpr狼疮小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例与细胞因子IL-4 的表达呈显著正相关（P=0.002，图5）。

图5 MRL/lpr狼疮小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例与细胞因子IL-4表达的相关性分析Fig.5 Correlation between proportion of IgG1+plasma cells and expression of cytokine IL-4 in spleen of MRL/lpr lupus mice

3 讨论

SLE 是一种以大量自身抗体产生、免疫复合物的形成及免疫复合物沉积组织、器官为突出表现的自身免疫性疾病［13-15］。目前，糖皮质激素和非特异性免疫抑制药物仍是临床上治疗SLE 的一线药物，但长期使用激素及免疫抑制剂会产生明显的毒副作用［16-17］。因此，寻找有效的替代药物至关重要。IMQ是一种TLR7激动剂，在临床上主要以软膏形式应用于银屑病和皮肤肿瘤相关的治疗，临床疗效显著，具有使用简单、方便、副作用小等优点，然而在自身免疫性疾病方面的研究较少［18］。

研究显示TLR7 主要分布于细胞内，通过识别靶细胞内的病毒核酸产生Ⅰ型干扰素和促炎症释放因子，触发免疫应答［19-20］。TLR7 可表达于淋巴细胞，尤其是 CD4+T 细胞［21］。Th2 细胞是一类主要的CD4+T 细胞，其可特异性地产生细胞因子 IL-4［22-23］。研究发现，Th2 细胞与IL-4 在SLE 的发展中起重要作用。例如：IL-4 是一种T 细胞生长因子，能促进Th0 向Th2 方向转化，使Th2 细胞因子产生增多，进而促进SLE 患者自身抗体的免疫应答反应，加重SLE 的病理损伤［22，24］。研究显示，与正常 BALB/c 小鼠相比，MRL/lpr 小鼠脾脏组织中IL-4 mRNA 表达明显升高［25］；SLE 患者 PBMC 体外培养产生的 IL-4较对照组升高；狼疮鼠模型研究发现抗IL-4 单抗可有效降低抗ds-DNA 含量，并且预防狼疮肾炎发病［26］；与对照组相比，SLE 患者体内 Th2 细胞比例明显升高，且血清IL-4水平与SLE疾病活动指数（SLE‐DAI）和 Th2 细胞数量显著相关［25-27］。因此，如何调控IL-4 水平及Th2 细胞比例在寻求治疗SLE 的靶向药物方面尤为重要。

研究显示，IMQ 能抑制CD4+T 细胞分化和功能性细胞因子的表达。本研究分别在BALB/c 正常小鼠和MRL/lpr狼疮小鼠体内进行了研究，结果表明：与Veh 组相比，IMQ 组小鼠脾脏中Th2 细胞比例明显降低；DXM 组 MRL/lpr 小鼠脾脏中 Th2 细胞比例明显升高，但对BALB/c 小鼠脾脏中Th2 细胞比例上调不显著；与DXM组相比，IMQ组BALB/c正常小鼠和MRL/lpr 狼疮小鼠脾脏中Th2 细胞比例明显降低。免疫球蛋白IgG1 作为SLE 主要致病性抗体，在SLE 的发展中起重要作用，而细胞因子IL-4 的水平又与IgG1 水平直接相关［28］。因此，研究组分别检测了BALB/c 正常小鼠和MRL/lpr 狼疮小鼠脾脏中IgG1+浆细胞的比例。结果显示：与Veh组相比，IMQ组小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显降低；DXM 组BALB/c 小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显升高，但对MRL/lpr 狼疮小鼠脾脏中Th2 细胞的比例上调不显著；与 DXM 组相比，IMQ 组 BALB/c 正常小鼠和MRL/lpr 狼疮小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例明显降低。为了进一步证实细胞因子IL-4 与IgG1 水平的相关性，研究组对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏中IgG1+浆细胞的比例与细胞因子IL-4 的表达进行了相关性分析，结果表明：MRL/lpr 狼疮小鼠脾脏中IgG1+浆细胞比例与细胞因子IL-4 的表达呈显著正相关。提示IMQ 可能通过抑制Th2 细胞比例和细胞因子IL-4 的表达，进而影响IgG1+浆细胞的比例，从而降低免疫球蛋白IgG1 的表达，对MRL/lpr 狼疮小鼠的治疗起到了一定的效果。

综上所述，本研究通过研究IMQ 对MRL/lpr 狼疮小鼠Th2 细胞IgG1+浆细胞的影响，发现IMQ 能明显抑制MRL/lpr 狼疮小鼠Th2 细胞的比例和细胞因子IL-4 表达，降低IgG1+浆细胞比例，从而减少免疫球蛋白IgG1 表达，减缓SLE 的发生，为IMQ 成为治疗SLE的靶向药物提供了新的数据。