循环血液中的环状RNA在消化系统肿瘤中的研究进展①

杨立羊 张新军③ 王庆领 苗 吉 （宁波市北仑区人民医院，宁波315826）

消化系统肿瘤严重威胁全球人类生存健康。据最新全球研究报告显示，全球发病率最高的10种肿瘤中消化系统肿瘤占据5 种，分别为结肠癌、胃癌、肝癌、直肠癌、食管癌，死亡率最高的10 种肿瘤中消化系统肿瘤占据6 种，分别为胃癌、肝癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、直肠癌，并且消化系统肿瘤的发病率呈逐年上升趋势［1］。目前，用于消化系统肿瘤的诊断及预后评估的常用方法包括内镜检查、肿瘤标志物（CEA、CA199、AFP 等）检测、影像学检查等，由于侵入性、敏感性和特异性较低，它们在临床应用中存在一定的局限性［2-3］。因此寻找侵入性小，敏感性及特异性高的检测方法用于消化系统肿瘤的早期诊断及预后评估非常重要。

环状 RNA（circular RNAs，circRNAs）由线性前体mRNA 反剪接产生，是一种没有游离3'-5'末端的共价闭环结构的RNA 分子，具有数量多、结构稳定、高度保守、特异表达等特性［4］。它能通过充当mi-RNA 分子海绵、调节基因转录及剪接、参与蛋白质的翻译等参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移及肿瘤进展等病理过程［5-7］。近几年来，研究发现人类血液中存在成千上万的circRNAs，并且它们高度稳定，能够抵抗高温、极端酸碱度以及长期冷冻贮藏等恶劣条件［8-9］。以上发现表明了circRNAs 具有作为肿瘤循环生物标志物的潜力。本文就循环血液中circRNAs 的来源以及其在消化系统肿瘤中的临床价值进行总结，旨在为消化系统肿瘤的诊断及预后提供新的非侵入性生物标志物，为其治疗靶点的选择提供参考。

1 循环血液中circRNAs的来源

对于循环血液中circRNAs 来源的猜测主要来自以下几个方面：①外泌体是主要来源：外泌体是由细胞产生、脱落进入体液循环的囊泡，它可携带circRNAs 等多种分子进入血液循环，通过在血液中转移这些分子参与细胞间的通讯，进而影响肿瘤的生物活性，如增殖、侵袭和转移、免疫调节、转移前生态位的生成和血管生成的刺激［10-11］；②组织或细胞的损伤、坏死或凋亡被动释放RNA：正常情况下，细胞内的ncRNAs 不易进入循环，但在组织损伤或细胞坏死时会发生，破损细胞和组织的被动泄漏是一个不需要能量的过程。在肿瘤转移或慢性炎症的情况下，原发部位的组织或细胞可能破裂，释放细胞内的ncRNAs 进入循环［12］。某些血细胞（如血小板和单核细胞）也可通过这种被动方式释放RNA进入循环，因为它们的半衰期相对较短；③细胞主动释放RNA：细胞直接释放无外泌体包被的RNA ，其方式与释放某些激素和细胞因子类似，首先将RNA 装入细胞内的小的分泌囊泡或颗粒中，然后通过分泌囊泡或颗粒与细胞膜融合，将RNA 释放到循环中。与激素和细胞因子的分泌类似，这种分泌方式可在有或无细胞刺激的情况下发生［13-14］；④其他来源：治疗干预也可能导致循环核酸的存在［15］。

2 循环血液中的circRNAs 在消化系统肿瘤中的临床作用

随着生物学技术的发展，目前发现循环血液中的circRNAs 在肿瘤的早期诊断、预后评估以及药物疗效预测方面发挥着重要作用［16-17］。并且研究表明，在消化系统肿瘤诊治中，血液中的circRNAs 将能为其提供非侵入性生物标志物，并能在其治疗靶点的选择上提供参考（如表1）。

表1 循环血液中的环状RNA在消化系统肿瘤中的作用Tab.1 Role of circRNAs from circulating blood in digestive system neoplasms

3 循环血液中的circRNAs与食管癌（esoph⁃agus cancer，EC）

EC 发病率及死亡率较高，90%的EC 为食管鳞癌（esophageal squamous carcinoma，ESCC）［43］。近年来，尽管在ESCC 治疗方面取得了一定进展，但患者预后仍较差，5 年总生存率仅为 20%~30%［44］。目前临床上诊断ESCC 的血清学指标敏感性和特异性较低。因此探索新的血清学标志物用于EC 的诊断及预后是至关重要的。

3.1 诊断价值 WANG 等［18］在对比 87 例 ESCC 患者和53例健康人血浆中circ_SLC7A5的表达水平时发现，circ_SLC7A5 在ESCC 患者血浆中的表达水平明显升高，建构受试者工作特征（relative operating characteristic，ROC）曲线评估诊断价值显示，ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.771 7，说明circ_SLC7A5对ESCC具有较好的早期诊断价值。

3.2 预后价值 血浆中的circ_SLC7A5 在ESCC 患者预后评估上也具有重要作用。研究显示circ_SLC7A5 与 TNM 分期呈正相关，且 Kaplan-Meier生存分析和log-rank 检验结果显示，与circ_SLC7A5表达水平较低的ESCC 患者相比，circ_SLC7A5 表达水平较高的ESCC 患者生存时间明显缩短。另外单因素和多因素分析表明，circ_SLC7A5 表达水平和TNM分期均为ESCC患者总体生存率（overall survival，OS）的独立预后指标［18］。由此说明血浆中异常表达的circ_SLC7A5 对ESCC 具有较好的早期诊断及预后评估价值，有望成为非侵入性生物标志物。

4 循环血液中的circRNAs 与胃癌（gastric cancer，GC）

GC的诊治仍然是肿瘤学领域的一个挑战，其生存率、治愈率低，复发率高，预后差，且目前国内对GC 的早期诊断率不高［45］。近年来，大量研究显示，血液中异常表达的circRNAs 可能成为GC 诊断、进程监测及预后评估的特异标志物，对GC 患者的诊治及预后评估具有重要临床意义。

4.1 诊断价值 GC 患者血浆中circ_0000520 的表达较正常人明显下调，建构ROC 曲线分析发现，其AUC 为0.896 7，敏感性及特异性分别为82.35%、84.44%。并且circ_0000520 表达水平在CEA 阳性患者中较低，但表达水平与其他临床病理特征无关系［21］。说明血浆中 circ_0000520 对 GC 患者具有较好的诊断价值。circ_0000190 在GC 患者组织及血浆中表达下调。血浆中circ_0000190 表达水平与CEA 相关，CEA 阳性患者 circ_0000190 水平较高。分析血浆中circ_0000190 的诊断价值，提示AUC 为0.60，敏感性为0.414，特异性为0.875。并且组织和血浆中的circ_0000190 联合诊断时，其敏感性和特异性明显增加，分别为 0.712 和 0.750，AUC 增加到0.78，因此circ_0000190作为一种血液标志物，可能提高GC 的诊断价值［22］。血浆中的circ_0001017和circ_0061276可以有效区分GC 患者与正常人群，构建ROC 曲线分析发现，血浆circ_0001017、circ_0061276的AUC值分别为0.851、0.849，显著高于组织中同类circRNAs 的诊断价值，并且血浆中这两种circRNAs 联合诊断时，AUC 升高至 0.912，此外，组织与血浆中的circRNAs 联合诊断时，较单一组织circRNAs 的灵敏度及特异度增加，并且阳性预测值（relative positive predictive value，PPV）和阴性预测值（negative predictive value，NPV）明显增加，显著提高了诊断的准确性［23］。

4.2 预后价值 Circ_002059 在GC 患者中表达下调，对GC 患者具有较高的诊断能力。此外，circ_002059 低表达与患者远处转移、TNM 分期显著相关，并且GC 患者术前、术后血浆中的circ_002059表达水平具有显著性差异［24］。由此说明，circ_002059也是胃癌的预后因素。在GC 患者组织及血浆中，circ_0001017和circ_0061276表达均明显下调，术后患者血浆中的两种circRNAs 表达水平显著升高，恢复至正常人水平，并且术后表达水平恢复组的GC患者，无论术前在何分期，均有较长时间的无病生存率（disease free survival，DFS）。此外，术后血浆中circ_0001017 表达水平恢复情况可以作为GC 患者DFS 的独立预后指标。另外，组织及血浆中circ_0001017、circ_0061276 表达水平与远处转移和肿瘤大小相关，血浆中circ_0001017 和circ_0061276 水平的降低与较高的总体死亡率和TNM III-IV期显著相关，并且低表达组OS明显低于高表达组。单变量分析和多变量分析显示，血浆circ_0001017 和circ_0061276是GC患者OS的独立预后指标［23］。

4.3 治疗靶点 血浆circ_0021087 不仅对GC 患者具有较好的诊断及预后评估价值，而且还能提供治疗靶点。circ_0021087 在GC 的血液和细胞中显著下调，下调的circ_0021087 促进GC 细胞的增殖、迁移。通过对胃癌circ_0021087-miRNA-mRNA 调控网络的预测，确定了3种miRNA（miR-1286、miR-184和miR-450b-3p）及205 个靶基因，生物信息学分析显示此调控网络可能与GC 发展有关［25］。由此说明circ_0021087可能是GC的治疗靶点。

5 循环血液中的circRNAs 与胰腺癌、胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）及CCA 是常见的消化系统恶性肿瘤，早期诊断难度大，发展迅速，侵袭转移能力强，复发率及死亡率高［29，46］。因肿瘤对放化疗敏感性差，目前手术治疗是唯一可行的治疗方式［47］。此外，近年来肿瘤发病率呈上升趋势，因此迫切需要寻找合适的生物标志物以及检测对PDAC及CAA特殊的治疗靶点。

5.1 诊断价值 研究发现circ_0000284 不仅在CCA 细胞、组织中表达上调，而且在患者血浆外泌体中表达也明显上调。有趣的是，外泌体介导的circ_0000284 对周围正常细胞具有促癌作用。进一步的实验探索了circ_0000284 的致癌机制，发现它可通过竞争性结合miR-637，导致淋巴细胞抗原-6e（lymphocyte antigen-6e，LY6E）表达增加，进而引起CAA 的发生发展［27］。由此说明，血浆外泌体 circ_0000284 可作为CCA 非侵袭性的诊断性标志物，同时也能提供治疗靶点。

5.2 预后价值 血浆外泌体circ_PDE8A 表达水平在PDAC 患者中明显升高，并且circ_PDE8A 的高表达与十二指肠侵犯、血管侵犯以及TNM 分期有关。生存分析显示，外泌体circ_PDE8A 高表达与低生存率有关，多变量分析也表明，外泌体circ_PDE8A 高表达是OS 的独立风险因素［28］。因此，血浆外泌体circ_PDE8A 的高表达是个预后不良因素。研究发现circ_IARS 在转移性胰腺癌患者的血浆外泌体中表达上调，并且circ_IARS 的高表达与肿瘤血管浸润、肝转移、淋巴结转移以及TNM 分期有关。单因素及多因素生存分析显示，circ_IARS 高表达是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素，并且生存曲线分析提示，circ_IARS 高表达组患者的生存时间明显短于circ_IARS低表达组［29］。由此可见，血浆外泌体中异常表达的circ_IARS 是影响胰腺癌患者预后的一个主要因素。

5.3 治疗靶点 血浆外泌体circ_PDE8A 与PDAC患者的肿瘤侵袭和进展相关。上调circ_PDE8A 可促进PDAC 细胞的迁移和侵袭，抑制circ_PDE8A 的表达过程则被阻断。进一步研究发现circ_PDE8A的促癌作用与circRNA-miRNA-mRNA 调控网络有关，circ_PDE8A 通过海绵 miR-338 从而上调MACC1，进而刺激MET 通路促进肿瘤进展，另外ERK 通路也被证实与肿瘤侵袭有关［28］。因此，circ_PDE8A 可作为分子靶点用于胰腺癌的靶向治疗。血管内皮通透性的增加与肿瘤转移及侵袭有关。研究发现，血浆外泌体中表达上调的circ_IARS可增加血管内皮的通透性，并且发现circ_IARS发挥这种效应与其竞争性结合miR-122，下调miR-122的表达，增加下游靶基因RhoA 的表达和活性有关，而circ_IARS 表达受抑制时，此通路效应则相应被阻断［29］。由此可见，血浆中circ_IARS/miR-122/RhoA通路可能为转移性胰腺癌治疗药物的研发提供思路。

6 循环血液中的circRNAs与肝癌

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌，也是世界范围内癌症相关死亡的主要原因。90%HCC的发生与慢性肝病和肝硬化有关［48］。尽管目前检测方法广泛应用，但70%的HCC 患者在晚期才被确诊［49］。因此，阐明 HCC 发生发展的生理病理机制，寻找有效的诊断和治疗靶点是当务之急。

6.1 诊断价值 研究发现，表达上调的circ_00-51443 可在G0/G1 期阻滞细胞周期进程，促进HCC细胞凋亡，抑制细胞增殖。qRT-PCR 结果显示，HCC 患者血浆外泌体中的circ_0051443表达水平明显低于健康对照组。构建ROC 曲线检测血浆外泌体circ_0051443 区分HCC 患者与正常人的价值，提示AUC为0.808 9［30］。说明血浆外泌体circ_0051443具有较好的早期诊断价值。ZHANG 等［31］对 104 例HCC 患者、57 例肝硬化患者、44 例乙型肝炎患者和52例健康对照者的血浆circ_0001445表达水平分析时发现，HCC 患者血浆circ_0001445表达水平最低，肝硬化及乙型肝炎患者其次，并且circ_0001445 表达水平与血清AFP 水平相关，血清AFP< 20 μg/L HCC 患者的血浆circ_0001445表达水平显著低于血清 AFP≥20 μg/L HCC 患者。构建 ROC 曲线区分HCC患者与健康对照组，提示AUC为0.862，特异性和敏感性分别为94.2%和71.2%，此外，血浆circ_0001445 也可用于区分HCC 患者与肝硬化患者（AUC=0.672），和乙型肝炎患者（AUC=0.764）。其次，血浆circ_0001445 联合AFP 诊断时，各对比组AUC 明显增加，较单纯使用血浆circ_0001445 或血清 AFP 诊 断 准 确 性 更 高［31］。 因 此 ，血 浆 circ_0001445可能成为一种新的诊断HCC的生物标志物。

6.2 预后价值 外泌体circPTGR1 能促进HCC 细胞的侵袭及迁移，与HCC 患者预后不良有关。研究发现，circPTGR1 在HCC 不同临床分期中的表达差异显著，表达水平随着TNM 分期进展而升高。生存分析显示，circPTGR1 水平低的患者生存率高于cir‐cPTGR1 水平高的患者，提示circPTGR1 低表达的HCC 患者预后优于circPTGR1 高表达的HCC 患者［32］。研究发现circ_100338 在转移性肝癌细胞及其分泌的外泌体中均为高表达，并且circ_100338表达水平与HCC 细胞的转移能力呈正相关。术后患者血清外泌体circ_100338 的变化可以早期预测HCC 的肺转移，且敏感性高于AFP。此外，在接受根治性肝切除术的HCC 患者血清中，外泌体circ_100338 的持续高表达可能是肺转移和生存不良的风险指标［33］。

6.3 治疗靶点 体内外实验表明外泌体circ_0051443可显著抑制HCC增殖，进一步研究显示，这种抑制作用可能通过上调BAK1 表达实现。BAK1是miR-331-3p 的潜在靶基因，miR-331-3p 模拟物能降低BAK1表达，然而上调的外泌体circ_0051443能显著抑制这种作用。由此说明，circ_0051443 可以通过海绵miR-331-3p 进而调控BAK1 表达，抑制HCC 进展［30］。提示 circ_0051443 可能是 HCC 治疗的一个关键靶点。circPTGR1 在HCC 中表达上调，进一步研究发现，外泌体circPTGR1 可通过circPT‐GR1-mir449a-MET 通路促进HCC 的迁移和转移。circPTGR1 的表达水平与MET 水平呈正相关，与miR449a 呈负相关，另外，miR449a 的高表达，可导致MET 水平降低，而miR449a 表达受抑制，能使MET 水平升高，此外，敲低circPTGR1 可逆转miR449a水平的降低和MET表达水平的升高［32］。由此说明，circPTGR1-mir449a-MET 是促进 HCC 进展的关键，circPTGR1可能是HCC治疗的靶点。

7 循环血液中的circRNAs 与结直肠癌（colorectal cancer，CRC）

CRC 是世界上最常见的癌症之一，发病率位居第三，死亡率位居第二［1］。导致CRC 生存率较低的主要原因是缺乏合适的早期诊断方法，以及不能采取及时有效的治疗方式。因此，找到理想的生物标志物和治疗靶点是提高CRC生存率的重要突破口。

7.1 诊断价值 与健康对照组相比，CRC 患者血浆 中 3 种 circRNAs（circ_CCDC66、circ_ABCC1 和circ_STIL）的水平明显降低。ROC 曲线分析显示，3 种 circRNA 组合面板的 AUC 值为 0.780，诊断价值高于CEA 和CA199。将3种circRNA 与CEA、CA199联合应用时，可提高CRC 的诊断能力，AUC 提升为0.855。此外，在CRC 癌前病变患者血浆中，circ_CCDC66 和circ_ABCC1 水平降低，术后血浆circ_CCDC66 水平明显升高。另外，这3 种circRNA组合面板提高了诊断CEA 和CA199 阴性CRC 的能力［36］。PAN 等［38］对CRC 患者、良性的肠道疾病（be‐nign intestinal diseases，BIDs）患者以及健康人血清外泌体中circ_0004771 水平分析时发现，CRC 患者血清外泌体circ_0004771 表达明显上调，其术后表达明显降低。并且发现circ_0004771 具有很高的早期诊断价值，在区分早期CRC 患者及各分期CRC 患者与健康人时AUC 分别为0.86、0.88，并且敏感性及特异性较好。此外，对于良性病变与早期CRC 也具有良好的鉴别能力，AUC 为0.81，敏感性为81.43%，特异性为74.29%，说明circ_0004771 有望成为循环肿瘤标志物用于CRC 早期诊断。CRC 血浆中 circ_0082182、circ_0000370 明显上调，而 circ_0035445 表达下调，与其在组织及细胞中的表达方式相同。在诊断价值方面，circ_0000370 的AUC 最高，为 0.8152，circ_0082182 、circ_0035445 的 AUC分别为0.7371、0.7028。当三者联合时AUC 增加至0.8347，突出了它们作为一组早期诊断CRC 标志物的优越性［39］。

7.2 预后价值 血浆circ_ABCC1 除了具有诊断价值以外，它还与CRC 预后有关。研究发现血浆circ_ABCC1 表达水平与肿瘤的增殖和进展有关，血浆circ_ABCC1 低表达与肿瘤TNM 分期晚、肿瘤数目多以及淋巴结转移和远处转移相关［36］。外泌体circ_0004771 在CRC 患者血清中的表达升高是由肿瘤引起的。循环外泌体circ_0004771 的表达水平与患者TNM 分期和远处转移显著相关，circ_0004771高表达预示着CRC 患者预后不良［38］。血浆中异常表达的circ_0082182、circ_0000370 与淋巴结转移关系密切，而circ_0035445 表达与TNM 分期密切相关。此外，circ_0082182和circ_0035445表达水平在术前、术后存在显著性差异［39］。说明血浆中这3 种异常表达的circRNAs与CRC患者预后有关。

7.3 治疗靶点 研究发现circ_ABCC1在CRC外泌体中表达上调，促进CRC 的发生及转移。进一步研究发现，这种促癌作用与Wnt/β-catenin 通路的激活有关，提示 circ_ABCC1 可能是 CRC 治疗的靶点［37］。circVAPA 在组织及血浆中表达均上调，ROC 曲线提示其具有较高的诊断价值，此外，研究发现circVA‐PA的促癌作用可能与其海绵作用有关，它能与致癌通路相关的miR-101 结合，miR-101 过表达与circ-VAPA 沉默具有类似的抑癌作用，circVAPA 过表达引起的促癌作用可通过上调miR-101 表达来逆转［40］。说明circVAPA可能成为CRC的治疗靶点。

8 总结与展望

血液是临床诊断中最常用的标本，因其具有简单、快速、无侵袭性等优点，许多研究关注于循环生物标志物的识别。circRNA 具有特殊的结构和特性，有望成为新的生物学标志物，目前已在消化系统肿瘤患者血液中检测到了不少circRNAs 稳定存在，并与肿瘤发生发展有关，这为消化系统肿瘤早期诊断和预后评估提供非侵入性生物标志物，为靶向治疗提供精准靶点。但目前研究处于初级阶段，许多问题有待解决，例如血液中circRNAs 来源较广，无法明确检测到circRNAs 是否为来源于肿瘤，实验结果的准确性有待验证；其次血液标本的质量受诸多因素影响，需要排除（饮食、运动等）外界因素引起circRNAs 含量的异常；此外，有些消化系统肿瘤的作用机制仍不明确，需进一步探索。本课题组相信通过临床医务人员以及科研人员的不断努力，未来有望将circRNAs 作为非侵入性生物标志物用于肿瘤临床，以及为肿瘤提供精准的治疗。