小分子多肽（FNS007）对关节炎大鼠T细胞亚群的影响①

张彦景 刘 琰 张建新 （河北医科大学第一医院，石家庄050031）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种进展性、破坏性滑膜炎，会影响骨骼和关节，被公认为是一种全身性自身免疫性疾病，T 细胞亚群失衡在其发病机理中非常关键［1］。目前RA 的治疗药物主要用于减轻患者疼痛，缓解症状，而针对其免疫学作用的药物相对较少。FNS007 是一个小分子多肽，一种新型生物制剂，可直接作用于T 细胞，经过前期的研究发现FNS007 可明显改善关节炎大鼠的炎症评分，下调关节炎大鼠的炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平，对胶原诱导性关节炎（collagen-in‐duced arthritis，CIA）大鼠有治疗作用［2］。本文在前期研究的基础上分析其治疗作用与调节T细胞亚群平衡的关系，为其进一步应用到临床提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Lewis雌性大鼠，6~7周龄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；牛Ⅱ型胶原蛋白（Collagen type Ⅱ）、不完全弗氏佐剂（incom‐plete Freund's adjuvant，IFA 购 自 Chondrex 公 司 ；FNS007 购自石家庄菲尼斯生物技术有限公司；FITC-anti-CD4抗体、PE-anti-IFN-γ抗体、PE-anti-IL-4抗体购自 BD 公司；PE-anti-IL17A 抗体、APC-anti-CD25 抗体购自 eBioscience 公司；PE-anti-Foxp3 抗体购自BioLegend 公司；电子天平（型号T5000）购自常熟市双杰测试仪器厂；流式细胞仪（型号FACSCali‐bur）购自BD 公司；CO2培养箱（型号MCO-175）购自SANYO 公司；离心机（型号Centrifuge 5810R）购自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 建立CIA 大鼠模型 在冰浴条件下，用0.05 mo/l L 乙酸溶液将Ⅱ型胶原均匀溶解，浓度为2 mg/ml，4℃过夜。然后将胶原溶液与相同体积的不完全弗氏佐剂混匀，充分乳化，取混合物100 μl于大鼠的尾根部皮内注射，1 周后重复此操作。每日早晚两次观察大鼠足爪变化，当大鼠关节肿胀且炎症评分达到2 分时随机入组，每组大鼠不少于8 只，另取8只空白大鼠作为对照，FNS007组按照0.5 m/l 100 g 的剂量尾静脉注射给药，两日一次，模型组和空白对照组按照相同方式给予相同体积的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS），给药21 d后处死大鼠。

1.2.2 大鼠一般状态及体重变化 观察各组大鼠的一般状态，包括精神面貌、活动情况等，记录体重，分析各组大鼠体重变化。

1.2.3 大鼠关节炎症评价 根据大鼠关节状况进行评分，严重程度：0 分=无关节肿胀；1 分=轻度，出现红肿症状；2 分=中度，红肿加重且大鼠行动稍有不便；3 分=重度，红肿进一步加重，大鼠活动受限；4 分=超重度，大鼠关节出现畸形乃至不能负重。大鼠入组后两天进行一次评分，直至给药结束。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞分型 在大鼠炎症评分最高时开始给药，两日一次，连续21 d，末次给药结束后处死大鼠，腹主动脉取血，对血样进行处理，取0.6 ml 血样加入0.6 ml 培养基，并加入50 ng/ml的PMA及1 μg/ml的离子霉素，在37℃、5%CO2条件下孵育2 h，其后加入0.1%BFA 继续孵育2 h 即可。在流式管中先加入胞外抗体（FITC-CD4 抗体及APC-CD25抗体），然后加处理好的血样150 μl，振荡混匀，避光孵育20 min。经过裂红、固定、破膜，然后加相应的胞内抗体（PE-IFN-γ 抗体、PE-IL-4 抗体、PE-IL-17A 抗体、PE-Foxp3 抗体）进行细胞内染色，以同型匹配抗体处理的血样作为阴性对照，流式细胞仪检测并分析各细胞亚型的比例。

1.2.5 免疫组化检测滑膜组织中IL-17 的表达 取膝关节滑膜组织制作石蜡切片，脱蜡水化，过氧化物酶内源性阻断，微波炉内抗原修复，动物血清封闭，滴加一抗（兔抗1∶100），4℃ 过夜，加生物素化二抗（山羊抗兔）和SP 溶液，DAB 显色，分化，脱水，透明，封片，光镜观察。用PBS替代一抗作为阴性对照，显微镜下观察，细胞质及细胞核内棕黄色颗粒即为阳性表达。

2 结果

2.1 各组大鼠基本情况 空白对照组大鼠毛色鲜亮，精神状态佳，活动自如，自给药开始至结束的21 d 中体重平均增长28.13 g；模型组大鼠精神萎靡，行动不便，毛色脏污，足爪红肿，与空白对照组相比，自第5 天开始体重明显降低（P<0.01、P<0.05）；与模型组比较，FNS007组大鼠精神状态有所好转，体重在第5、7、9天明显升高（P<0.05，图1）。

图1 FNS007对CIA大鼠体重的影响Fig.1 Effect of FNS007 on weight in CIA Rat

2.2 大鼠炎症评分 与空白对照组比较，模型组大鼠炎症评分从第1 天至21 天明显升高（P<0.01）；与模型组比较，FNS007 组大鼠炎症评分在第2、3、4、5和7、8天明显降低（P<0.05、P<0.01，图2）。

图2 FNS007 对CIA 大鼠炎症评分的影响Fig.2 Effect of FNS007 on inflammation score in CIA rats

2.3 各组大鼠T 细胞分型情况 如表1 所示，模型组大鼠Th1、Th17 细胞所占比例较空白对照组明显升高，Th2、Treg 细胞所占比例明显降低（P<0.05、P<0.01）；与模型组相比，FNS007 组大鼠 Th1、Th17细胞所占比例降低，Th2、Treg 细胞所占比例升高（P<0.01，图3）。

图3 FNS007 对 CIA 大鼠 Th1、Th2、Th17、Treg 细胞分型的影响Fig.3 Effect of FNS007 on proportion of Th1，Th2，Th17，Treg in rats

表1 FNS007 对 CIA 大鼠T细胞分型的影响（）Tab.1 Effect of FNS007 on proportion of T cell in CIA rats（）

表1 FNS007 对 CIA 大鼠T细胞分型的影响（）Tab.1 Effect of FNS007 on proportion of T cell in CIA rats（）

Note：Compared with control group，1）P<0.01，3）P<0.05；compared with model group，2）P<0.01，4）P<0.05.

Treg（%）5.96±0.66 4.15±0.691）5.52±0.682）Groups Control Model FNS007 Th1（%）0.15±0.04 0.39±0.171）0.16±0.094）Th2（%）4.41±0.88 3.53±0.523）4.53±0.502）Th17（%）0.69±0.09 1.08±0.081）0.87±0.092）

2.4 各组大鼠滑膜组织中IL-17 染色结果 呈现在细胞核和细胞质里的黄棕色颗粒状细胞为阳性染色的细胞，免疫组化结果显示：空白对照组大鼠滑膜扁平，结构清晰，无炎症细胞浸润及血管增生，未见或少见IL-17 阳性染色细胞；而模型组大鼠滑膜组织粗糙，结构混乱，大量炎症细胞浸润，IL-17阳性染色细胞明显增多，且多数集中在滑膜衬里层及衬里下层；与模型组比较，FNS007 组炎症细胞少量存在，IL-17阳性染色细胞数明显减少（图4）。

图4 FNS007 对CIA 大鼠滑膜组织IL-17表达的影响Fig.4 Effect of FNS007 on expression of IL-17 in CIA rats synovial tissues

3 讨论

RA 是一种以关节滑膜腔内强烈的免疫激活和多种全身表现为特征的慢性炎症性疾病，如果不及时治疗，两到三年后可能发生永久性伤残，给患者带来严重危害。目前RA 的病理生理机制尚不完全清楚，有文献报道T细胞通过调节适应性免疫应答，在RA 的发展中发挥作用，作为T 细胞的主要子集，Th1、Th2、Th17和Treg细胞亚群的失衡十分关键，调节T 细胞极化可能是潜在的治疗靶标［3-4］。FNS007是一条小分子多肽，其取代了Ⅱ型胶原肽中与T细胞结合的氨基酸，而与人类白细胞DR 抗原（HLADR）结合的氨基酸保持不变，在RA 发病的初始环节，与抗原提呈细胞表面的HLA-DRB1 竞争性结合，同时破坏自身抗原与HLA-DRB1 的结合，进而抑制“TCR-抗原肽-HLA”三分子复合物形成，阻断T细胞激活的初始信号，从而延缓RA 的病情进展达到治疗目的，属于直接作用于T 细胞的生物制剂［5］。CIA 是一种成熟的关节炎模型，与RA具有相同的发病机制和生理特点，而Lewis 雌性大鼠的关节诱导发生率较高，对于评估抗RA 药物的疗效非常重要［6］。

在前期的药效学基础上，本课题组采用Ⅱ型胶原诱导Lewis 雌性大鼠制作CIA 模型，结果发现FNS007 在CIA 鼠模型中可发挥抗炎和免疫调节作用。与空白对照组相比，模型组T 细胞分化趋向Th1、Th17 型细胞，而向 Th2、Treg 型细胞偏移减少。Th1 细胞可促进补体定型、诱导与细胞毒性相关抗体产生［7］。据文献报道，Th1细胞可分泌促炎症细胞因子TNF-α和IFN-γ，TNF-α可诱导关节炎症和血管翳的形成，导致软骨和骨骼的侵蚀破坏；而IFN-γ 则通过激活巨噬细胞来推动炎症的进展，在RA 关节组织和滑液中均可检测到大量IFN-γ，T细胞分化偏向Th1细胞，表明炎症细胞因子分泌会相应增加，从而加重关节炎症［8］。对于Th2 细胞来说，其激活可以抑制RA 中的炎症反应，IL-4是Th2细胞分泌的标志性细胞因子，体外研究发现，IL-4可通过影响破骨细胞和减少分泌促炎症细胞因子来抑制骨吸收，而给予外源性IL-4 可以减轻CIA 小鼠的临床症状、关节损伤和炎症反应［9-10］。本实验中，模型组T 细胞不正常偏移导致Th2 细胞减少，是诱发关节炎症的原因之一。T 细胞分化向Th17 型细胞偏移同样会加重关节炎症，Th17 细胞主要通过分泌IL-17 促进自身免疫性疾病的进程，同时IL-17 又能进一步促进Th17 细胞的分化并增强Th17 细胞活性，IL-17 还可以诱导促炎细胞因子如 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的产生，并与其形成一个正反馈的环路［11］。本研究中，利用免疫组化技术特异性检测滑膜组织中IL-17 的表达，模型组大鼠滑膜组织IL-17 表达升高，炎症细胞浸润，异常增生，符合关节炎模型大鼠T 细胞向Th17偏移的规律。与Th17细胞相反，Treg细胞介导抗炎反应，通过分泌IL-10和转化生长因子TGF-β抑制其他T 细胞亚型，并保持自身免疫耐受状态［12-13］。有研究发现，RA 患者滑膜中的炎症细胞因子可抑制Treg 细胞增殖和分泌功能性细胞因子，在RA 发展进程中，Treg 细胞的比例呈减少趋势［14-15］。本研究中模型组大鼠Treg 细胞比例明显下降，与上述文献报道一致。在给予FNS007 干预后，CIA 大鼠体内Th1/Th2/Treg/Th17 的比例发生变化，Th1、Th17 所占比例减少，而Th2、Treg 所占比例增加，表明FNS007 可以通过抑制Th1、Th17 的优势应答，促进原始T 细胞向Th2、Treg 分化来发挥作用，滑膜组织中RA 的炎性生物标志物IL-17 的表达进一步佐证了这个论点。

综上所述，FNS007 可以调节 Th1、Th2、Treg 和Th17 细胞的分化，减少向致炎型细胞Th1、Th17 转化，增加向抑炎型细胞Th2、Treg转化，通过恢复T细胞的正常平衡并干扰滑膜的免疫细胞入侵来治疗或减轻RA 症状，这为其临床治疗RA 和其他T 细胞免疫相关疾病提供了新的治疗策略。