单克隆抗体制备技术的最新进展①

林金香 王心睿③ （福建省儿童医院，福州350011）

单克隆抗体是由B 细胞接受抗原刺激所产生的。20世纪末Kohler 和Milstein构建了以杂交瘤细胞方式制备单克隆抗体的技术，该方法简单，但鼠源单抗在临床使用中易产生人抗鼠抗体反应，导致抗体效价降低和免疫原性强等问题，于是嵌合抗体技术和人源化技术随后出现使之得到一定改善，但仍存在诸多缺点［1-3］。近二三十年来，随着生物信息学、结构生物学、人工智能等学科和技术的发展，单克隆抗体制备技术也不断更新，促使单克隆抗体在基础研究、医学诊断、临床治疗等方面展现出良好的应用前景。本文就单克隆抗体制备技术的最新进展，如抗体库技术、转基因和新型动物模型技术、单个B 细胞抗体技术、多学科和计算机辅助抗体制备技术做一概述，并讨论其存在问题和未来运用前景。

1 抗体库技术

抗体库技术是通过基因工程手段克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，接着重组到原核表达系统，然后通过设置抗原、结合和洗涤等条件，筛选出特异性抗体基因的技术。抗体库技术除了能用于筛选抗体外，又能对已有的抗体进行改造，如降低鼠源性、提高亲和力和稳定性等。

1.1 抗体库构建 抗体库始于基因文库构建，目前有天然抗体库、半合成抗体库、全合成抗体库和组合库。1996 年，VAUGHAN 等［4］首次从健康人的外周血B细胞扩增出轻链和重链可变区基因并构建天然抗体库。天然抗体库根据供体状态可分为单纯文库和免疫文库。单纯文库是从幼稚动物或健康人类供体的B 细胞衍生而来，具有广泛靶标的亲和力［5］；而免疫文库是经免疫过的动物或特定抗原疾病痊愈的患者身上获取，经历天然亲和力成熟，对特定靶标有高亲和力，如从MERS 痊愈者的血液B 细胞构建而成的文库［6］。近年来，半合成抗体库及全合成的人HuCAL 库相继被构建［7-8］。还出现一类整合了2 种或3 种不同类型的子库而成的组合抗体库，提高了实用性［9］。

1.2 抗体库筛选 目前常用的筛选技术主要包括噬菌体展示技术和酵母双杂交展示技术。1985 年SMITH［10］首次提出噬菌体展示技术，将外源基因插入丝状噬菌体中，将相应的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而可以筛选出特定的结合物或具有亲和特性的蛋白，该技术是目前发展最成熟、最广泛的应用。1990 年 JOHN［11］将噬菌体展示技术运用于抗体研发，2002 年首个完全人源化的阿达木单抗获FDA 批准上市。噬菌体展示技术能够克服免疫耐受，在制备靶向肿瘤、毒性抗原、自身抗原、高度保守的抗原等抗体中具有很大的优势，现已拓展至可快速识别与多种靶分子（蛋白质）结合的肽或抗体片段，甚至也可采用细胞、组织作为抗原［12］。此外，噬菌体展示技术和酵母展示技术因易于筛选高亲和力的抗体变体和使用高通量筛选方式，现已被广泛用于抗体亲和力的成熟［13］。

抗体库具有能够模拟天然表位的结构和功能、免疫源性好、生产成本相对低等优势，至今为止已有9 个通过此技术产生的抗体药物获得FDA 批准，但是该技术在库容量、多样性和亲和力等很多方面待改进［14］。

2 转基因动物模型和新型动物模型技术

传统上抗体来源于野生型的小鼠、大鼠、兔等，这些抗体治疗使用受限，但转基因动物及各种新型动物模型能产生更多样的、亲和力成熟的、全人源的抗体，满足市场的不同需求。

2.1 转基因动物模型 转基因动物是通过将携带人抗体重链和轻链的基因簇导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。这种动物所携带的人DNA 片段具有相对完善的功能，可进行同型转换和亲和力成熟，使所产的抗体具有成为药物的天然优势。目前通过HuMAbMouse、XenoMouse、VelocImmune Mouse、TC Mouse 转基因小鼠平台已研发出21 款全人源抗体上市，这4种转基因小鼠和所产抗体各有不同的特点，如表1所示。最近有学者利用H2L2转基因小鼠制备针对SARS-CoV-2 的中和抗体正在进一步测试中［19］。此外，还有一些转基因动物在开发测试中，如KyMouse、OmniRat/Mouse/Chicken、Trianni Mouse等。

表1 世界上人类抗体转基因动物的主要平台Tab.1 Major platforms of human antibody transgenic animals in world

2.2 新型动物模型 除了来源于鼠的抗体外，自然界还有多种动物产生不同特性的抗体，如纳米抗体、兔抗体、鸡抗体等。1993 年首次报道在骆驼血清中发现只有重链的抗体，将此重链抗体的可变区单独克隆并表达出来，仍具有与原重链抗体相当的结构稳定性和抗原结合活性，因分子量较小，故又被称为纳米抗体［20］。由于纳米抗体稳定性高、容易表达、不易出现空间位阻等优点，因此引起广泛关注和研究。2018 年，首个纳米抗体Cablivi 获批上市，用于治疗成人获得性血栓性血小板减少性紫癜［21］。近期有学者利用大羊驼研发出能够中和SARS、MERS 以及新冠病毒的假病毒的多种“纳米抗体”，有望被开发成“中和喷雾”［22］。

与鼠源单抗相比，兔抗体具有更高的亲和力、多样性、人源化改造更简单等优势。2019 年两款兔来源单抗药物Brolucizumab 和Eptinezumab 获 FDA批准，分别用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性和预防偏头痛［23］。此外，鸡、鸵鸟等拥有完全不同的IgY抗体，这类抗体具有耐酸、耐受蛋白酶等独特特性，未来可开发成消化道用药或外用，并已有学者用鸵鸟抗体用于人的头发修复［24-25］。

转基因和新型动物模型由于其独特的自身优势，已成为抗体制备的主要技术之一，但仍存在研发周期长、投入资金大、技术难度高，且转基因易使动物体细胞发生突变，产生不完全的人抗体序列等缺点，需进一步改进。

3 单个B细胞技术

单个B 细胞抗体技术通过体外分选、克隆或测序、表达、测试等流程获得具有抗原特异性的抗体，此类抗体具有轻重链可变区天然配对、全人源、亲和力高等特点，运用此技术能在少量细胞中高效地分离出潜在的单克隆抗体。

3.1 鉴定和分离单个B 细胞 B 细胞分选技术的核心是从人体中挑选出针对特定抗原的B 细胞，并将其BCR（B cell receptor）开发为重组单克隆抗体。一种筛选策略是从患者或经过疫苗免疫的志愿者体内抽取外周血，再借助荧光激活、激光捕获显微切割、液滴微流体等分选技术［26-28］；另一种是通过分析对特定疾病具有抵抗能力的人进行免疫系统的深度分析，寻找具有富集现象的BCR 序列，再做进一步检测，如CAO等［29］通过对60个新冠肺炎康复患者血中的B 细胞进行单细胞分离和高通量测序，并通过患者自身B 细胞序列对比和全部样本的B 细胞序列对比，从8 400个抗体序列中筛出400个富集度最高的抗体序列来合成，从中找到14个具有抗新冠病毒的高活性中和抗体。

3.2 克隆或测序单个B 细胞 单个B 细胞分选后需要进行克隆，目前比较成熟的是基于流式多色分选技术的B 细胞克隆技术，根据B 细胞表面标记物分选出具有抗原特异性的B 淋巴细胞，然后从单个B 细胞克隆出编码抗体的重链和轻链基因［26］。常规B 细胞克隆技术耗时长、效率低，而直接对B 细胞进行单细胞VDJ测序则耗时短。SETLIFF 等［30］开发了一种用于抗体发现和疫苗开发的LIBRA-seq 技术（linking B cell receptor to antigen specificity through sequencing），通过测序将B 细胞受体和抗原特异性连接起来，具有针对广泛抗原靶标的特点，也大大提高抗体制备效率。

3.3 高通量表达和测试 单个B 细胞被克隆或测序后，需对其进行表达和测试，以确定每种单克隆抗体的特性。目前比较成熟的高通量单个B细胞抗体发现平台，有基于Beacon“单细胞光导系统”的技术平台［31］，它将微流控的纳升级微反应器技术、光电定位技术和计算机系统等结合在一起，形成一体化多功能单细胞平台，能够完成单细胞分选、分析、培养、测试以及导出等功能；也有基于单液滴微流控技术的完全集成的CelliGO技术平台，实现超高通量抗体选择和测试，能以物种激动的方式深入挖掘免疫库，探索诸如多跨膜蛋白等具有挑战性的目标［28］。

近几年，因单个B 细胞抗体技术具有许多不可替代的优势，在肿瘤免疫和传染性疾病上如火如荼开展，但仍存在诸多问题需要解决，如特异性抗原的选定、分选策略、高通量表达和测试等。

4 多学科和计算机辅助抗体制备技术

随着生物信息学、结构生物学、免疫学、抗体工程学等学科的发展，以及大数据、人工智能、高通量、自动化等技术的成熟，从不同方面辅助抗体制备技术的更新迭代。

4.1 多学科辅助抗体制备 生物信息学使用生物算法和相关的软件工具来处理大量生物学数据，从中挖掘出重要信息，尤其是能从核酸和蛋白质序列分析出其结构功能相关的信息，可用于分析疾病机体抗体组库的变化，预测抗原与抗体的靶位，进而提高抗体制备的精准性。有学者通过与SARS-CoV密切相关的序列同源性和生物信息学方法来预测和验证对SARS-CoV-2 具有免疫应答的潜在B 和T细胞表位，绘制病毒表位和其相对免疫原性的图谱，为抗体设计提供关键信息［32］。JU 等［33］采用高通量的抗体分离和克隆抗体家族的生物信息学鉴定，从8 例新冠感染者的单个B 细胞中分离并鉴定出206 株 SARS-CoV-2 RBD（receptor-binding domain）特异性单克隆抗体。

结构生物学可在分子和原子水平上解析病原体或抗原与机体受体的蛋白结构，如准确定位新冠病毒受体结合域和人受体ACE2 的相互作用位点，发现关键的受体结合氨基酸位点，比较SARS-CoV和SARS-CoV-2之间的抗原差异性，找到SARS-CoV-2比SARS 结合力更强的抗原表位［34-35］。以上研究揭示新冠病毒侵染细胞的结构基础和关键抗原靶位，为多种中和性抗体的抗原表位的选择和覆盖奠定了坚实的基础。

免疫学研究诠释机体免疫系统对抗原的反应和处置过程，免疫系统中的抗体既可清除病原体，又可促进病原体的复制，加重对机体的损害，因此深入研究人类对病原体的具体免疫反应机制进而指导抗体研发是十分重要。如分析新冠肺炎患者血清中病毒抗体的表达和分布规律，IgG 抗体在发病后一周被检测到，在第2 周起迅速增加，在第4 周达滴度高峰［36］。又如研究抗体依赖性增强冠状病毒进入的分子机制，评估抗体如何影响病毒进入表达病毒受体，Fc 受体或两种受体的细胞，这些对新冠病毒抗体的核心抗原表位选择，抗体结构改造，单个B细胞分选的病人选择和取样时间节点选择等具有重要的指导意义［37］。

抗体工程学将抗体的结构和功能的关系建立起来，可对抗体进行人源化、点突变、片段化等改造，又能构建新的抗体或制备类抗体分子，使其具有适当的抗原亲和力、效应功能和生物物理特性，进而调动机体发挥不同的免疫调节机制，提高抗体的有效性和安全性［38］。

此外，随着基因组学、蛋白质组学、反向遗传学等学科的兴起，有学者针对呼吸道合胞病毒研发出蛋白从头设计精准诱导中和抗体产生的方法［39］，此方法颠覆传统思维，它可直接靶向特异性的抗原表位，促使机体免疫系统产生预期的特定抗体，类似疫苗，并且比疫苗更加的精准，省去体外抗体制备的一系列繁琐工作。

4.2 计算机辅助抗体制备 近几年开发出的免疫表位数据库、整合抗体序列和结构的数据库，这些数据库推动了计算机辅助抗体设计和虚拟筛选［40-41］。人工智能技术在知识提取和建模分析中展现出巨大潜力，在抗体药物研发方面应用前景广泛［42］。利用人工智能可加快对新冠肺炎患者的诊断和疾病预后的评估，也可对新冠病毒的结构进行解析与预测，又能在短短几天内识别并筛选数亿种潜在的抗体治疗方法［43-44］。此外，随着各类检测技术的进步和深度学习与人工智能在检验领域的不断应用，抗体制备技术平台也迎来了集成化、自动化、智能化、高通量的新发展趋势［45］。计算机辅助技术仍存在一些局限性，需要对算法，评分功能，数据库和基准测试工具等方面进行改进和完善。

5 展望

单克隆抗体的各种制备技术日新月异，但仍各有优缺点，需要进行资源整合。抗体库技术的文库可来源于免疫过的野生型或转基因动物，也可来源特定疾病痊愈患者所分选出来的单个B 细胞，总之几种制备技术可以交叉使用。结构生物学解析抗原与抗体的结合部位、二代测序、人工智能等技术可以整合到抗体药物的设计、发现、筛选、测试等过程中，如李慧瑾等［46］将计算机虚拟技术和噬菌体文库技术结合起来预测抗原抗体结合部分，进而有效筛选H1N1 流感病毒HA 抗原表位。未来随着各类新技术的产生和整合，将大大加快研发速度，可根据特定需要或疾病发病机制制备不同特性的抗体。