疏水性纺织品抗病毒性能测定方法研究

黎玉莲，孙廷丽，陈嘉乐，徐碧霞，谢小保

广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东 广州 510070

2019年以来，新冠肺炎疫情持续在全世界蔓延，在抗击新冠肺炎疫情的过程中，病毒相关防治知识得到广泛传播，具有抗病毒功能的家纺产品也成为人们关注的热点之一[1]。疫情防控期间，口罩和防护服等疫情防控用纺织品，作为人体第一道保护的防护纺织品，已成为抗病毒感染的有力屏障，是不可或缺的防疫保障物资。防护纺织产品具有过滤作用，因此口罩佩戴是预防病原微生物传染的有效措施之一。在病原菌感染风险高的公共场所，人们通过口罩对空气中的传染性病原菌进行过滤处理，可以控制疾病传染，保障人们的身体健康。各种病原微生物也因此截留在纺织品过滤层上，纺织品若没有抗微生物性能，病原菌微生物则会在滤层上聚集和繁殖，这将在使用过程中造成二次感染，严重危害消费者身体健康。

疫情防控用纺织品大多数是疏水性或防水性纺织品，而国际标准化组织制定的国际标准ISO 18184:2019《纺织品抗病毒活性的测定》主要适用于吸水性纺织品抗病毒性能检测[2]。该标准未提供对疏水性的纺织品处理的方法，导致该方法不适用于测试疏水性纺织品的抗病毒性能。疏水性纺织品有没有抗病毒性能，效果如何，则是消费者和生产研发机构共同关心的问题[3]。本文通过加入没有抗微生物性能的表面活性剂来改变疏水性的纺织品的吸水性能或使用不同的接种方式，比较疏水性样品抗病毒效果差异性，为建立疏水性纺织品抗病毒测试方法提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

本实验选取的纺织品样本由某抗病毒纺织品研发机构提供，吸水性的纺织品样本被命名为样品A，疏水性的纺织品样本分别被命名为样品B、C和D。

1.2 主要试剂和仪器

试验毒株与细胞：甲型流感病毒H3N2(ATCC VR-1679)，宿主细胞MDCK细胞(ATCC.CCL-34)。

相关培养基和试剂：胎牛血清(Gibco)，DMEM培养基(Gibco)，青霉素-链霉素双抗(Gibco)，磷酸盐缓冲液PBS(Gibco,pH 7.2,0.01M)。

主要试验仪器：二级生物安全柜(BSC-1360ⅡA2,广东环凯)、二氧化碳培养箱(INC153,Memmert)、低温超速离心机(Sorvall ST16R,Thermo Fisher)、倒置显微镜(ECLIPSE Ts2,Nikon)。

1.3 试验方法

1.3.1病毒悬液培养

从液氮罐中取出冻存的MDCK细胞，室温下融化，随后加入细胞培养液，于37 ℃的5%二氧化碳的培养箱中培养18 h～24 h，更换细胞培养液，待细胞长满单层备用。

将取出低温冻存的H3N2病毒毒种，于37 ℃水浴融化，随后接种于以长满单层细胞的细胞培养瓶中。加入针对流感病毒的含TPCK胰酶的DMEM，置于34 ℃温箱中培养，使之与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4或以上细胞出现病变时，将培养液取出，反复冻融3次，低温离心，将含病毒的上清液分装于灭菌离心管中，冷冻保存于-80 ℃备用。

1.3.2病毒滴度计数方法TCID50法

细胞预先以105(100 μL)每孔密度接种到96孔细胞培养板中，在5% CO2的37 ℃培养箱中培养。24 h后，移除旧的培养液，每孔加入100 μL新鲜的PBS缓冲液冲洗细胞三遍，100 μL浓度梯度的病毒悬液分别加入到预先接种细胞的96孔板中，对照组加入100 μL维持液做阴性对照(NC)，继续在37 ℃下培养1 h ～2 h后，弃去上清液，每孔加入100 μL新鲜的PBS缓冲液冲洗细胞，随后每孔加入100 μL针对流感病毒的含TPCK胰酶的DMEM继续34 ℃培养4 d～7 d。通过倒置显微镜观察细胞病变。确认细胞病变之后用behren和Karber方法计算病毒TCID50滴度。

1.3.3抗病毒活性实验

1.3.3.1 相同测试方法下吸水性不同的样品的抗病毒实验

根据ISO 18184标准，采用吸收法比较样品A、B、C和D抗病毒性能。详细步骤如下所述:取0.40±0.05 g样品，剪成约20 mm×20 mm大小，将其放入带盖子的容器灭菌备用。在对照样本和检测样本分别加入0.2 mL病毒滴度为1×107～5×107TCID50/mL病毒后孵育2 h，分别继续往瓶子里加入20 mL洗脱液进行洗脱，涡旋震荡5次，回收病毒计数。根据TCID50方法确定感染滴度。空白对照样为无抗病毒处理的标准无纺布，根据5次重复实验数据计算最终结果。

1.3.3.2 使用不同表面活性剂后的抗病毒实验

使用不同表面活性剂处理，进一步比较疏水性样品抗病毒效果差异性。按1.3.3.1制备样品，将接种病毒液加入0.5%吐温-80、0.01%Triton X-100或0.4%十二烷基硫酸钠作为分散剂，再按照1.3.3.1进行抗病毒测试，根据5次重复实验数据计算最终结果。

1.3.3.3 采取不同接种方式的抗病毒实验

采用不同接种方式，进一步比较疏水性样品抗病毒效果差异性。详述如下：

吸收法：同1.3.3.1。

贴膜法：将样品剪成约每片50 mm×50 mm，正面向上放入培养皿中灭菌备用。首先在对照样本和检测样本分别加入0.2 mL病毒滴度为1×107～5×107TCID50/mL病毒液，随后给贴膜实验组贴上50 mm×50 mm大小的覆盖膜。孵育2 h后，最后分别往培养皿里加入20 mL洗脱液洗脱，回收病毒计数。根据TCID50方法确定感染滴度。根据5次重复实验数据计算最终结果。

振荡法：取(0.40±0.05)g样品，剪成约10 mm×10 mm大小，放入三角烧瓶中灭菌备用。首先分别加入20 mL DMEM培养基到每个三角烧瓶中混匀。随后加入0.2 mL病毒滴度为1×107～5×107TCID50/mL病毒悬液震荡2 h。最后回收病毒计数。根据TCID50方法确定感染滴度。根据5次重复实验数据计算最终结果。

1.3.3.4 使用表面活性剂和采取不同接种方式的抗病毒实验

将接种病毒液加入0.5%吐温-80，再使用1.3.3.3的贴膜法和振荡法进行抗病毒测试。根据5次重复实验数据计算最终结果。

1.4 结果计算

抗病毒活性值(Mv)=对照样品lgTCID50/mL-抗病毒检测样品lgTCID50/mL。涉及数据统计学分析的均使用软件GraphPad Prism计算。

2 结果与讨论

2.1 相同测试方法下吸水性不同的样品的抗病毒效果

将吸水性纺织品样品A和疏水性纺织品样品B、C、D使用吸收法进行抗病毒性能的检测，5次重复试验平均值为最终结果。如图1所示，样品A吸水性能相对较好，抗病毒活性值相对较高，结果稳定，抗病毒平均值为(2.61±0.06)。疏水性样品B、C、D的抗病毒活性平均值分别为(1.08±0.35)、(1.68±0.43)、(1.02±0.30)。由于病毒悬液不能均匀分散到疏水性纺织品中，直接采用吸收法测试其抗病毒性能，结果普遍偏低且不稳定。

图1 相同测试方法下吸水性不同的样品的抗病毒活性值

2.2 使用不同表面活性剂后的抗病毒效果

将接种病毒液加入0.5%吐温-80、0.01%Triton X-100或0.4%十二烷基硫酸钠作为分散剂进行抗病毒测试。由图2可以看出，疏水性样品B经0.5%吐温-80、Triton X-100或十二烷基硫酸钠处理后与无任何处理的测试结果相比，其抗病毒效果有一定的提高，其中经0.5%吐温-80处理后的结果重复性较好且抗病毒效果有明显改善，其平均抗病毒活性值为(1.86±0.18)。样品C使用不同表面活性剂后，其抗病毒效果和其重复性均有提高。样品D使用不同表面活性剂后，其抗病毒效果无明显变化，但结果的重复性有所提高。具体结果见图2。仅使用表面活性剂改变吸水性能，抗病毒效果虽有一定的提高，但重复性较差。

图2 使用不同表面活性剂后的抗病毒活性值

2.3 采取不同接种方式的抗病毒效果

吸收法、贴膜法和振荡法三种不同接种方式被用来比较不同样品抗病毒效果，5次重复试验平均值为最终结果。从图3数据可知，对于疏水性样品B，采用贴膜法的抗病毒活性值为(2.15±0.23)，抗病毒效果显著的改善；采用振荡法的抗病毒效果也有明显的提高，而且结果稳定。样品C使用吸收法、贴膜法与振荡法的抗病毒活性值分别为(1.68±0.43)、(2.22±0.28)、(2.23±0.22)；与吸收法相比，其他接种方式结果稳定性明显提高。样品D使用贴膜法或振荡法的抗病毒效果也有相对的改善，抗病毒结果的重复性也有明显的提高。采用贴膜法或振荡法进行实验，增加病毒液在样品中分散均匀性，疏水性纺织品抗病毒结果均有明显的改善，结果的稳定也有所提高。

图3 采取不同接种方式的抗病毒活性值

2.4 使用表面活性剂和采取不同接种方式的抗病毒效果

选用效果较好的0.5%吐温-80表面活性剂，进一步使用贴膜法和振荡法进行抗病毒测试，5次重复试验平均值为最终结果。如图4所示，样品B、C、D的抗病毒效果与传统吸收法测试方法相比，抗病毒效果大大改善，而且结果稳定。样品B采用0.5%吐温-80+振荡法的抗病毒活性值达到(2.57±0.09)。样品C采用0.5%吐温-80+贴膜法和采用0.5%吐温-80+振荡法的抗病毒活性值分别为(2.52±0.13)、(2.51±0.10)。样品D采用0.5%吐温-80+贴膜法和采用0.5%吐温-80+振荡法的抗病毒活性值分别为(1.79±0.12)、(1.86±0.07)。说明通过采用不同接种方式并加入表面活性剂来改变吸水性能，与仅使用表面活性剂改变吸水性能或仅改变接触方式相比，疏水性纺织品抗病毒效果有更好的改善，抗病毒结果重复性好，可为将来建立疏水性的纺织品抗病毒测试方法提供参考依据。

图4 使用表面活性剂和采取不同接种方式的抗病毒活性值

3 结论

抗病毒织物主要是通过对病毒有灭活作用的整理助剂来实现其功能[4]。其作用机理包括抗病毒基团与病毒表面接触，并与蛋白衣壳结合，使其变性、变裂。变性使病毒损失对宿主细胞的吸附能力，失去生存的必要条件，变裂则使病毒衣壳内的核酸外流、断裂，遭到彻底破坏而失去感染性[5]。本实验通过加入表面活性剂提高疏水性纺织品中的吸水性能，采用不同接种方式探索提高疏水性纺织品吸水性能的策略，为建立疏水性的纺织品抗病毒试验方法提供科学依据。

抗菌纺织品的检测和评价标准已经较为完善，但目前我国尚没有抗病毒织物的国家标准，ISO18184：2019测试范围也仅规定了机织物和针织物、纤维、纱线、编织物等的测试方法，其测试方法采用的是吸收法。本文涉及到的目前广泛使用的的疏水性或弱吸水性能的纺织品产品有手术衣、口罩、手术罩单、毛巾、袜子、手套等，已作为抗病毒织物已经被广泛使用。但是ISO18184：2019抗病毒检测标准并不适用于上述的疏水性纺织品，因此还需要进一步研究建立新的测试方法。

探索疏水性纺织品抗病毒性能方法，积极研究制定疏水性纺织品抗病毒试验方法标准，以补充完善我国抗微生物纺织品的标准体系，不仅可以规范市场，促进行业的良性竞争，而且也有助于提高产品的质量，增加产品的附加值，打破国外技术壁垒，实现我国纺织品行业的高质量发展。