双歧杆菌氧胁迫应答机制研究进展

刘亚萍，钱佳俊，郑雯清，易文涛，王世杰，杨 玲，艾连中，熊智强*

1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093;2.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018;3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家庄 050899

双歧杆菌(Bifidobacterium)属于细菌域、放线菌门、放线菌纲、放线菌目、双歧杆菌科、双歧杆菌属，是一类不运动、不产孢子、不产气和严格厌氧的革兰氏阳性菌，主要存在于哺乳动物的胃肠道(GIT)及口腔等环境。由于对人体健康具有生物屏障、改善胃肠道功能和抗衰老等重要生理功能，被认为是肠道健康的指示菌[1]。然而，双歧杆菌对氧气具有高度敏感性，氧不完全还原的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)可引起蛋白质错误折叠和聚集、DNA损伤和脂质过氧化等有害影响[2]。双歧杆菌作为一类具有重要经济价值的益生菌，其对氧敏感是限制在食品和医药等领域中应用的重要因素。因此，本文在蛋白水平上综述双歧杆菌中参与氧化胁迫的酶、分子伴侣和调节因子，理解双歧杆菌抗氧化胁迫机制，以期为双歧杆菌产业化应用提供理论指导。

1 双歧杆菌的活性氧损伤

分子氧(O2)是一种非极性小分子，可以自由跨越细胞膜，并从电子传递酶类暴露的还原基团接受外界电子，随着连续加入电子产生超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH-)等ROS[3]，其主要来源于生存环境的氧化还原反应、细胞内酶自氧化、NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)催化、其他竞争性微生物的释放等生理过程[4]。产生的ROS通过破坏双歧杆菌细胞膜磷脂、蛋白质、铁依赖酶和DNA/RNA的完整性对细胞产生毒害作用，导致双歧杆菌产生表达紊乱、代谢失调、细胞生长停滞甚至死亡等危害(图1)。

图1 双歧杆菌活性氧损伤

2 双歧杆菌氧胁迫应答机制

大肠杆菌是细菌中对氧化应激和防御机制研究最透彻的模式生物，当细胞受到外源性H2O2的胁迫时，其中OxyR和SoxRS作为ROS感应调节因子参与氧胁迫应答，激活烷基过氧化氢还原酶(Alkylhydroperoxide reductase,Ahp)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)等多种ROS清除酶，同时促进铁吸收储藏、Fe-S簇合成组装，抑制Fenton反应，并启动转录因子和sRNA表达，保护DNA和促进DNA损伤修复[5]。其他厌氧微生物中，乳酸菌在应答氧化胁迫时，细胞内产生超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、CAT等多种ROS清除酶[6,7]；巯基-二硫键氧化还原系统催化蛋白质二硫键/二巯基电子交换向巯基依赖酶类提供电子保持蛋白活性；GroEL、Hsp20、Clp和DanK等伴侣蛋白参与防止蛋白质变性、聚集和错误折叠过程[8]。

相比大肠杆菌和乳酸菌，在双歧杆菌基因组中未发现OxyR和SoxRS编码基因，但含有铁摄取调节因子Fur编码基因，然而对短双歧杆菌UCC2003铁调节研究中证实Fur不参与氧胁迫应答[9]。此外，双歧杆菌基因组中也没有编码谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)、CAT和SOD等常见的ROS清除酶类基因[10]。因此，大肠杆菌和乳酸菌的抗氧化胁迫机制并不适用于双歧杆菌，需探寻双歧杆菌ROS清除途径机制。对双歧杆菌生理、生化和组学分析发现，双歧杆菌氧胁迫应答呈现复杂且相互作用的网络。例如，ZOMER等在短双歧杆菌UCC2003中建立主要由clgR、lexA、hrcA和hspR等因子调控的氧化应激网络模型[11]。在双歧杆菌有氧培养过程中产生的Ahp是内源性H2O2的主要清除剂[12]；SATOH证实双歧杆菌中存在TrxR-AhpC系统，保护双歧杆菌免受氧化应激[13]；NOX和氧依赖性辅卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen III oxidase,HemN)参与动物双歧杆菌中对O2或H2O2的解毒[14]。分子伴侣和蛋白酶在氧化应激中起着关键作用，抑制由应激引起的蛋白质变性、聚集和错误折叠，保护多种蛋白质免受氧化损伤[15]。HUANG等从百岁老人粪便中筛出一株具有较强抗氧化的长双歧杆菌LTBL16，通过分析其基因组发现3个过氧化物酶(LTBL-000027、LTBL-000028和LTBL-000976)和1个NOX编码基因(LTBL-001911)，能改善抗氧化酶FoxO依赖性转录，降低细胞中ROS水平，这些基因的丰度可能与ROS清除率和耐氧有关[16]。MOZZETTI等利用固定化细胞技术培养双歧杆菌，筛选出一株适应过氧化氢的长双歧杆菌NCC2705-HPR2，与原始菌株相比存在两个参与跨膜运输的编码基因BL1404和BL0931，阐明其存在有助于提高双歧杆菌对氧化应激抗性[17]。

2.1 NAD(P)H氧化酶

NOX是产生ROS的主要来源，可将进入细胞的氧气进行氧化还原(图2)，产生O2-和H2O2[18]。乳酸菌中CAT可将H2O2还原为H2O[19]，但双歧杆菌中没有CAT编码基因。氧敏感型双歧杆菌中，表现出较高的NOX活性，耐氧型双歧杆菌则表现出极低的NOX活性[10]。在婴儿双歧杆菌中敲除nox可降低H2O2生成，减轻菌株对O2的敏感性[20]。因此，NOX是影响双歧杆菌氧胁迫耐受能力的重要因素。

2.2 硫氧还蛋白系统(Thioredoxin system,TrxR)

细菌通常利用Ahp两个亚基AhpF和AhpC还原细胞内过氧化物底物，来缓解细胞抗氧化压力[21]。在双歧杆菌中不含有AhpF，但含有AhpC和TrxR编码基因。TrxR是NAD(P)H依赖性二硫化物还原酶系统，负责多种过氧化物酶包括谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,Gpx)和AhpC的还原，发挥调节细胞内氧化还原状态的平衡。TrxR与AhpC相互作用构成TrxR-AhpC通路，保护双歧杆菌免受氧化应激(图2)。SATOH等从一株氧敏感双歧杆菌JCM1255T在有氧环境下的NOX活性组分中纯化得TrxR，证实TrxR-AhpC通路对氧化应激产生的H2O2进行降解，阐明其在双歧杆菌氧化胁迫应激中的调控作用[13]。双歧杆菌中含有类似于TrxR的TrxB(Thioredoxin reductase-like protein)，与大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的AhpF具有同源性，且过表达AhpC时TrxB的表达量也显著上调，表明TrxB受AhpC的反馈调节[12]。

2.3 保护铁硫蛋白(iron-sulfur proteins,Fe/S protein)

O2可通过Fenton反应直接攻击[Fe-S]酶中的铁离子(图2)，氧化释放出铁离子导致酶失活，同时产生的OH-继续攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，导致DNA损伤断裂，影响细胞的代谢与生长[22]。在大肠杆菌氧化胁迫机制中，H2O2激活OxyR和PerR转录调控以清除ROS、保护DNA、减少氧化毒性[23,24]。Fur可调控铁吸收，DNA结合类铁蛋白(Dps)清除游离铁以抑制Fenton反应[25]，铁硫簇组装蛋白(Suf家族)促进Fe-S簇蛋白合成[26]。尽管在双歧杆菌基因组中未发现OxyR和PerR编码基因，但含有fur、dps和sufBCD编码基因，可参与到Fe-S簇蛋白合成和保护，进而清除细胞内OH-，减轻ROS对双歧杆菌的损伤。

图2 双歧杆菌活性氧代谢途径

2.4 分子伴侣

2.5 调节因子

调节因子通过控制靶基因的转录表达，在双歧杆菌抗氧化胁迫应激中起到调控作用(表1)。例如，Dps参与羟自由基清除的调控[10]，非特异性结合DNA，防止DNA降解，通过结合氧化铁抑制Fenton反应产生OH-[28]。氧化胁迫可触发双歧杆菌的SOS响应，RecA和LexA是主要调节因子。正常生长条件下，SOS受LexA的抑制调控，氧化胁迫时DNA损伤导致复制区单链DNA积累，激活RecA使LexA解离并激活SOS中recA、recX和clgR等修复基因的表达[29]。

表1 双歧杆菌氧耐受相关的伴侣蛋白和调节因子

3 展望

双歧杆菌作为具有代表性和重要经济价值的益生菌，厌氧特性是影响其在工业应用的重要限制因素。因此，解析双歧杆菌氧胁迫应答机制并提高氧化胁迫耐受性是双歧杆菌工业化瓶颈的关键。通常提高双歧杆菌抗氧化胁迫方法包括添加保护剂、包埋法、与其他乳酸菌共培养和适应性训化。分子生物学研究发现双歧杆菌缺少ROS调节因子和清除酶等基因，导致氧化胁迫响应机制与其他厌氧细菌具有明显差异。本文在蛋白层面上总结双歧杆菌中参与氧胁迫响应的酶、分子伴侣和调节因子及其应答，未来可结合基因组、转录组和代谢组等多组学方法对双歧杆菌氧胁迫响应中关键基因和代谢物进行功能鉴定，为深入解析双歧杆菌抗氧胁迫机制提供依据。

近年来IncRNA、miRNA和sRNA等非编码RNA被大量研究[32]，在调控细胞凋亡和物质代谢等重要生理活动中起到关键作用。例如，大肠杆菌中存在sRNA SorX抑制调控多胺转运体的一个亚基的potAmRNA，降低亚精胺摄取，提高对单线态氧(Singlet oxygen)和氢过氧化物(Hydroperoxide)的敏感性，减轻氧化损伤[33]。虽然细菌抗逆相关的非编码RNA已有较多报道，但双歧杆菌非编码RNA研究尚处于起步阶段，对其开展生理功能鉴定和分子机制解析等研究，有望为系统阐释双歧杆菌氧胁迫应答提供新的方向。