基于电子顺磁共振波谱法的美拉德反应产物抗氧化活性研究

章银良，黄天琪，张陆燕，王明雷，王悦，陈科宇，李振城

(郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，郑州 450001)

美拉德反应(Maillard reaction，MR)，是指羰基化合物和氨基化合物在一定反应条件下发生的化学变化，这类化学反应会生成棕黑色聚合物——美拉德反应产物(Maillard reaction products，MRPs)[1-2]。MRPs中抗氧化活性成分受到美拉德反应条件的影响，高温和碱性条件下更有利于MRPs中例如还原酮、呋喃、类黑精等抗氧化活性物质的生成[3-5]。食品加工过程中合理利用美拉德反应能极大程度提高食品的风味、货架期等。例如，发酵黑化技术能减少不良气味并提高果蔬的抗氧化性及风味[6]。肉制品中肉香味主要通过美拉德等反应将香味前体物质转化形成[7]。某些羰基和氨基反应的MRPs的抗氧化活性甚至可以和人工合成的BHA、BHT相媲美，由于在食品热加工过程中这类反应经常发生，因此，MRPs也可被称为天然抗氧化剂[8-9]。

自由基，是一类性质十分活泼、具有非偶电子的基团或原子，对人体代谢有着重要的影响[10-11]。氧化应激会缩短生物体的寿命，过量的自由基积累会加速人体衰老[12-13]。筛选具有较强抗氧化活性的物质一直以来都是食品研究的热点[14]。电子自旋共振技术(electron spin resonance，ESR)能利用自由基的顺磁性直接以谱图的形式反映出自由基的含量，通过计算出待测样品的g因子，从而对样品所处的电子状态、化学环境进行定性判断，对自由基进行定性分析[15-16]。DPPH·是一种十分稳定的自由基，不需添加补集剂就能得到类似于手掌的五重峰谱图信号。常用于实验室检验电子顺磁共振波谱仪设备是否能正常运行以及反映物质的抗氧化活性能力[17-18]。紫色的DPPH与抗氧化活性物质反应会变成淡黄色，因此常借助紫外分光光度法判定物质的抗氧化活性，但此方法容易受到样品本身颜色的干扰，从而影响试验的准确性。ESR法能直接快速地检验DPPH·的含量，从而避免颜色的干扰[19-20]。本文以DPPH·清除率为指标，借助电子顺磁共振波谱法(ESR)比较不同反应条件下(反应温度、pH、反应时间、料液比)L-精氨酸和D-核糖组合反应的MRPs对DPPH·的清除能力，并设计均匀试验对模拟的美拉德反应条件进行优化，得到具有最强抗氧化活性的MRPs反应条件，为完善天然抗氧化剂的检测方法以及深入研究MRPs提供了参考依据。

1 材料、设备与方法

1.1 试剂与材料

D-核糖(AR)、L-精氨酸(AR)：北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠(AR)、无水乙醇(AR)：天津市永大化学试剂有限公司；盐酸(AR)：烟台市双双化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 (DPPH·，AR)：进口试剂。

1.2 仪器设备

SQP型电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；E-Scan型电子顺磁共振波谱仪 美国布鲁克科技(北京)有限公司；FE20型 pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型数显恒温油浴槽、HH-S型水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司；T6型新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 美拉德反应产物(MRPs)的制备

将试验样品单因素依次分为反应时间、pH、反应温度和料液比。制备MRPs的具体操作如下。

1.3.1.1 反应时间

称取12.5 g精氨酸和12.5 g核糖置于烧杯中，溶解于450 mL的去离子水中，用移液枪吸取HCl(4 mol/L)和NaOH(6 mol/L)调整pH至10.0，然后用去离子水定容至500 mL，混合均匀。量取10 mL反应液转移至25 mL带盖螺口试管中，密封严实后，置于120 ℃恒温油浴槽中反应20，40，60，80，100，120，140，160, 180，200 min。每组反应平行3次，反应结束后快速置于冰水中冷却并进行相关测定，剩余样品置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.1.2 pH

称取12.5 g精氨酸和12.5 g核糖置于烧杯中，溶解于450 mL的去离子水中，用移液枪吸取HCl(4 mol/L)和NaOH(6 mol/L)调整pH为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，然后用去离子水定容至50 mL，混合均匀。量取10 mL反应液转移至25 mL带盖螺口试管中，密封严实后，置于120 ℃恒温油浴槽中反应l h，每组反应平行3次。反应结束后快速置于冰水中冷却并进行相关测定，剩余样品置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.1.3 反应温度

称取12.5 g精氨酸和12.5 g核糖置于烧杯中，溶解于450 mL的去离子水中，用移液枪吸取HCl(4 mol/L)和NaOH(6 mol/L)调整pH至10.0，然后用去离子水定容至500 mL，混合均匀。量取10 mL反应液转移至25 mL带盖螺口试管中，密封严实后，分别置于40，60，80 ℃水浴锅中反应l h。量取10 mL反应液转移至25 mL带盖螺口试管中，密封严实后，分别置于100，120，140 ℃恒温油浴槽中反应l h。在50 mL圆底烧瓶中加入25 mL混合液并安装冷凝回流装置，将圆底烧瓶置于160，180, 200 ℃恒温油浴槽中反应1 h。反应结束后快速置于冰水中冷却并进行相关测定，剩余反应液置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.1.4 料液比

准确称量核糖和精氨酸，使它们的质量比分别为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，溶解于45 mL的去离子水中，并分别用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液调整pH至10.0，然后用去离子水定容至50 mL，混合均匀。量取10 mL反应液转移至25 mL带盖螺口试管中，密封严实后，置于120 ℃恒温油浴槽中反应l h。反应结束后快速置于冰水中冷却并进行相关测定，每组反应平行3次，剩余样品置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 ESR检测方法

用石英毛细管吸取23.77 μL(d=0.93 mm，h=35 mm)待测样品，将石英毛细管手拿部分稍微向下倾斜，当混合液吸取部分产生空气柱后用手顶住并插入固体胶中密封底端，并将装好混合溶液的石英毛细管管壁上残留溶液以及底部固体胶用纸擦拭干净，缓慢倾斜放入石英筒套中，将筒套放入E-Scan量规，上下调节石英筒套位置，将E-Scan量规上刻度线指向待测溶液中间位置。立即放入电子顺磁波谱仪的谐振腔中，待仪器自动调谐完毕后开始测量。

ESR测定条件：参考李辉等[21]的方法，并稍作改变。频率9.792069 GHz，功率5.00 mW，中心磁场3487 G，扫描宽度100 G，调制幅度2.27 G，调制频率86.00 kHz，时间常数40.96，扫描时间83.88 s(20.97 s×4次)，横坐标点数512，接收机增益为3.17×103。

1.3.3 DPPH标准曲线的绘制

以无水乙醇作为溶剂，配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mmol/L的DPPH溶液，按照1.3.2所述方法进行测定，积分区域为(3450±0.01)G～(3525±0.01)G，并建立DPPH的ESR标准曲线。

1.3.4 暗反应时间的确定

将参数改成按时间扫描，单次扫描时间20.97 s，扫描间隔时间158.23 s，扫描总次数45次，其余参数与1.3.2所述一致。用移液枪吸取0.5 mL精氨酸和核糖组(料液比1∶1、反应时间60 min、反应温度120 ℃、pH 10)的MRPs与2.0 mL 0.5 mmol/L DPPH于棕色具塞刻度管中混匀并计时。按照1.3.2所述方式上样调谐，混合2 min后立即测量。反应0 min的强度值用空白组的DPPH的ESR谱图的第3个特征峰峰高表示。测量完毕后，对单次扫描好的DPPH的ESR谱图的第3个特征峰峰高进行测量，并建立MRPs与DPPH混合溶液的DPPH第3个特征峰峰高随时间的变化关系。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定

采用电子顺磁共振波谱法——ESR法。

参考Nanjo F等[22]、章银良等[23]的方法，并稍作修改。取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去离子水，配制成50倍稀释液，振荡摇匀。再取500 μL MRPs(去离子水溶液作为空白对照组)与2 mL 0.5 mmol/L DPPH于棕色具塞试管中振荡混合均匀。暗反应20 min后，立即放入电子顺磁波谱仪的谐振腔中，待仪器自动调谐完毕后按1.3.2所述方法开始测量。

将扫描波谱图传入布鲁克自带软件WINEPR-Processing中，对DPPH自由基ESR谱图进行二重积分，积分区域为(3450±0.01)G～(3525±0.01)G，将测量的二重积分值记为As。在相同操作条件下，以0.5 mL去离子水代替0.5 mL稀释后的样品溶液，作为控制组，并记录其二重积分值，记为Ac。美拉德反应产物对DPPH自由基清除能力可由下式计算得出：

1.3.6 均匀试验因素水平设计

选取核糖和精氨酸组合，以DPPH自由基(DPPH·)清除率为检测指标，采用 U10(108)均匀试验表，因素水平见表1。

表1 U10 (108)均匀试验因素水平表Table 1 The factors and levels of U10 (108) uniform test

1.4 统计分析

所有的试验均做3次平行，采用WINEPR-Processing、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相关方法进行处理，并用SPSS软件进行显著性分析(差异显著p<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 DPPH浓度和MRPs暗反应时间的确定

DPPH自由基是一种合成的、具有单电子、稳定的、以氮为中心的顺磁化合物。由于该自由基较为稳定，因此不需要捕获剂也能通过清晰的ESR扫描出谱图。不同浓度DPPH的积分值与浓度关系图(A)和ESR谱图(B)见图1。

A

B

由图1可知，DPPH的ESR信号为类似于手掌形状的五重峰, 随着DPPH浓度的升高，DPPH·峰形和峰宽基本保持不变, 高度发生了明显的变化。在0.1～1.0 mmol/L区间内DPPH浓度与ESR谱图的二次积分值具有良好的线性关系，线性方程为y=7.9594x+0.0526，相关系数R2=0.9918。DPPH·清除的过程实质上是DPPH·含量减少的过程。因此，可以通过DPPH的ESR谱图的二次积分值来反映DPPH浓度的变化。在0.1～ 0.5 mmol/L区间内DPPH浓度与ESR谱图的二次积分值具有更好的线性关系，线性方程为y=7.7692x+0.1196，相关系数R2=0.9953。综合考虑李辉等运用ESR对DPPH的优化试验与不同浓度DPPH的二次积分值与浓度关系曲线图，因此，选用0.5 mmol/L的DPPH用于MRPs对DPPH·清除率的测定。

由图2可知，在混合DPPH与MRPs后，DPPH·数量急速下降(DPPH·数量亦可用DPPH的ESR谱图的第3个特征峰峰高强度值表示[24])，因此，MRPs对DPPH·的清除是一种极为快速的反应过程。反应5～140 min，DPPH的ESR谱图的第3个特征峰的强度随着时间的增加缓慢降低，这可能是毛细石英管中的DPPH·与空气中的氧气反应所致。结合单次实际试验检测样品的数量以及总共消耗时间(约为20 min，20～40 min强度值极差为0.059)，因此选定暗反应时间为20 min。

图2 DPPH·第3个特征峰强度随反应时间变化关系图Fig.2 The relationship between the intensity of the third characteristic peak of DPPH· and the reaction time

2.2 单因素试验(电子顺磁共振法测定MRPs对DPPH·的清除率)

单因素pH、反应温度、反应时间和料液比对DPPH·清除率的影响见图3～图6。

图3 不同pH下MRPs对DPPH·清除率的影响Fig.3 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different pH values

图4 不同温度下MRPs对DPPH·清除率的影响Fig.4 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different temperatures

图5 不同时间下MRPs对DPPH·清除率的影响Fig.5 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different time

图6 不同料液比下MRPs对DPPH·清除率的影响Fig.6 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different solid-liquid ratios

由图3可知，MRPs对DPPH·的清除率随着pH值的增大而增大。在pH为12时，MRPs对DPPH·的清除率达到最大。在酸性条件下(pH 3～7)MRPs对DPPH·的清除率呈缓慢增加趋势，当模拟MRPs反应体系变为碱性条件时，MRPs对DPPH·的清除率迅速增大，这说明碱性条件更有利于美拉德反应产物中抗氧化活性物质的生成。由图4可知，反应温度低于80 ℃时，MRPs缓慢产生，在所测温度范围内随着反应温度的升高持续增大，并在200 ℃时达到最大清除率，这说明高温有利于MRPs中抗氧化活性物质的生成。由图5可知，MRPs对DPPH·的清除率随着反应时间的增加而增大，反应60～160 min时MRPs生成较为迅速，在180～200 min时，MRPs对DPPH·的清除率基本无太大变化，这说明MRPs中具有抗氧化活性的物质形成于反应的初始阶段，同时在后期的反应过程中，MRPs中具有抗氧化活性的物质不会随着反应时间的增长而分解，MRPs在模拟美拉德反应体系中具有一定的稳定性。由图6可知，MRPs对DPPH·的清除率随着核糖或精氨酸在模拟体系中的增加而增大，核糖∶精氨酸为3∶1时，MRPs的抗氧化活性最强。

2.3 均匀试验结果

根据均匀试验表(见表2)，模拟不同条件下精氨酸与核糖发生的美拉德反应并得到相应的MRPs，根据1.3.5.1的方法进行DPPH·清除率测定，试验结果见表2。

表2 均匀试验结果Table 2 The uniform test results

以ESR清除率为指标，均匀试验结果采用Mathematics 4.0软件分析，结果如下：

ln[1];=<< Statistics `Linear Regression`

ln[2];=data ={{20, 5, 2.5, 120, 6.55}, {40, 8, 0.5, 200, 21.28}, {60, 11, 1, 100, 35.42}, {80, 3, 3, 190, 7.11}, {100, 6, 0.4, 80, 6.07}, {120, 9, 1.5, 180, 34.53}, {140, 12, 3.5, 60, 37.49}, {160, 4, 0.333, 160, 17.06}, {180, 7, 2, 40, 8.51}, {200, 10, 0.667, 140, 55.66}};

ln[3];=(regress=Regress[data, {1, x1, x2, x4^2, x4}, {x1, x2, x3, x4}];

Chop[regress, 10^(-6)])

Out[3];={Parameter Table→

估计标准误差T检验值P值1-69.12628.08978.544970.000361448X10.1151240.02031485.666990.00237995X24.889890.40974111.93410.0000728167X42-0.001987620.000480516-4.136430.00902832X40.6335560.1200545.277260.00325227

R2→0.976958，RAdj2→0.958524，

Estimated Variance→12.0821

ANOVA Table→

自由度平方和均方F比P值模型42561.33640.33452.99870.000277436误差560.410312.0821总和92621.74

由数据分析结果可得出：反应时间(X1)、pH(X2)、反应温度(X4)对清除率有极显著的影响(P<0.01，分别为0.0024，0.000073，0.0033)，影响顺序为pH>反应时间>反应温度。反应底物的料液比(X3)无显著影响。自由基清除率Y与各个影响因素的回归方程为：

Y=-69.13+0.1151X1+4.8899X2+0.633556X4-0.001988X42，回归方程P=0.0002774，所以回归方程有效，对应的方差分析表见表3。

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variances

从回归方程结合试验实际，得到最佳反应条件：反应时间为200 min，pH为12，反应温度为160 ℃，此时理论最佳清除率为63.04%(比优化前最佳的值55.66%提高了13.27%)，料液比的均匀试验结果为不显著，综合考虑试验成本等因素，因此模拟美拉德反应最优条件为：核糖∶精氨酸1∶1、pH 12、反应时间200 min、反应温度160 ℃。经试验验证，在此优化条件下得到的DPPH·清除率为64.34%，理论值与实际值的相对误差为2.02%，且DPPH·清除率远超过其余各项单因素以及均匀试验试验值。说明按均匀试验优化后的最优条件组合进行模拟的美拉德反应生成的MRPs具有最强的抗氧化活性，优化结果可靠。

3 结论

本试验以精氨酸与核糖为美拉德反应模型，模拟了不同反应时间、反应温度、料液比、pH后得到的MRPs，用DPPH·清除率来表征，运用电子顺磁共振波谱法对其抗氧化活性进行研究。结果表明，DPPH·在一定浓度范围内和ESR谱图的二次积分值具有良好的线性关系，适用于DPPH·清除率的测定。MRPs与DPPH·反应迅速，DPPH·在外部环境影响下，也会影响测量结果的准确性，因此应该合理选取暗反应时间，从而减少了试验误差。

ESR的单因素结果表明，MRPs的抗氧化活性随着反应温度的升高和反应时间的延长而逐渐增强，在温度低于80 ℃和酸性条件下MRPs的抗氧化活性较低，高温和碱性条件更有利于MRPs反应。通过增大反应物的浓度能够提高MRPs的抗氧化活性。均匀试验表明，反应时间、pH、反应温度对清除率有极显著影响(P<0.01，分别为0.0024，0.000073，0.0033)，影响顺序为pH>反应时间>反应温度。反应底物的料液比无显著影响。综合考虑试验成本等因素，因此模拟美拉德反应最优条件为：核糖∶精氨酸1∶1、pH 12、反应时间200 min、反应温度160 ℃。经试验验证，在此优化条件下得到的DPPH·清除率为64.34%，理论值与实际值的相对误差为2.02%，优化结果可靠。