基于重组EP153R蛋白的检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法的建立

程 佳，李 遥,，刘英楠，钟秋萍，史馨瑾，魏常青，谢振华，廖欣欣，宋影影，陈鸿军

（1.山西农业大学动物医学学院，山西 030801；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.中国农业科学院生物安全研究中心，上海 200241）

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染野猪和家猪引起的一种烈性传染病，发病猪特征病变为全身性淋巴结出血、坏死，尤其是内脏淋巴结病变最为明显，病猪脾脏充血、肿大，强毒株致死率接近100%[1]。2018年8月，在中国沈阳市沈北新区暴发中国首例ASFV疫情，在接下来几个月时间呈点状逐渐蔓延至全国[2]。ASFV是目前唯一已知的DNA虫媒病毒，目前已知有24种基因型，经Zhou等[2]研究结果表明，传入中国的ASFV为基因Ⅱ型。

不同的ASFV毒株基因组大小为170～193 kb，其中包含151～167个开放阅读框，编码超过150种蛋白质[1]。ASFV在其感染历程中的各个阶段编码类型众多的免疫逃逸蛋白，通过不同途径来实现免疫逃逸，从而达到病毒在宿主体内转移和在宿主细胞内大量复制的目的[3]。ASFV EP153R蛋白是由EP153R基因编码的一种C型凝集素类（C-type lectins,CTLs）免疫逃逸蛋白且高度N-糖基化[4]，原始大小约为18 kDa。Hurtado等[5-6]研究表明，EP153R主要在ASFV感染早期通过抑制Caspase-3活性和P53的反式激活活性来抗细胞凋亡，它还可以通过影响MHC-Ⅰ类分子递呈到细胞膜表面这个过程来逃避CD8+T细胞的杀伤。由此可见，EP153R蛋白在协助病毒免疫逃逸发挥着重要作用。

昆虫细胞-杆状病毒表达系统兼具真核和原核表达系统的优势，在高效大量表达目的蛋白同时，还能对目的蛋白进行一系列翻译后修饰，如N-糖基化修饰、磷酸化修饰等[7]。因此，本研究首先利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行EP153R蛋白真核表达，鉴定rEP153R的免疫原性，建立基于ASFV rEP153R蛋白的间接ELISA血清学检测方法，以期为后续EP153R蛋白功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒、实验动物与血清 草地贪夜蛾卵巢细胞系（Sf9）、pET32a-EP153R质粒由本实验室保存，4～6周龄无特定病原体（specific pathogen free,SPF）的BALB/c纯系雌性小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠rEP153R蛋白多克隆抗体由本实验室制备。

1.2 主要试剂 Sf-900™ Ⅱ SFM、Bac-to-Bac™杆状病毒表达系统、Cellfectin™ II Reagent昆虫细胞转染试剂、PageRuler（26616）购自Thermo Fisher公司；大肠杆菌DH5α购自擎科生物公司；T4 DNA Ligase、BamHⅠ-HF®和XhoⅠ购自New England BioLabs公司；DNA胶回收纯化试剂盒购自Omega公司；质粒小提试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根公司；FITC标记兔抗鼠IgG购自Sigma公司；4', 6'-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6'-diamidino-2-phenylindole, DAPI）购自Molecular Probe公司，HRP标记兔抗鼠IgG购自Jackson公司；Phanta®Max Super-Fidelity DNA聚合酶；BCA Protein Quantification Kit购自南京诺唯赞生物有限公司；HRP标记羊抗猪IgG（H&L）购自艾博抗（上海）贸易有限公司；ID Screen®非洲猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒购自法国ID.vet公司；伪狂犬病病病毒（Pseudorabies virus, PRV）阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）阳性血清、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）阳性血清、ASFV血清（临床阴性血清60份、阳性血清2份、待检血清46份）均由内蒙古金宇生物技术股份有限公司提供，以上血清均通过ASFV竞争ELISA抗体检测试剂盒检测确认。

1.3 rEP153R B细胞抗原表位预测 利用BepiPred1.0 Server预测ASFV SY18毒株中EP153R潜在的B细胞抗原表位，在预测的抗原表位中设计多肽序列“GNEEKNYNNASNYCKQ”，送至生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 rEP153R蛋白多克隆抗体的制备 将200 μg EP153R多肽与100 μL的弗氏完全佐剂震荡混匀至乳化，用1 mL注射器对小鼠进行腹腔注射，以200 μL/只的剂量免疫5只6周龄BALB/c小鼠并做好标记；初免后第7 d再取200 μg EP153R多肽与100 μL的弗氏不完全佐剂震荡混匀至乳化，以相同的免疫方式与剂量对小鼠进行二免；分别于二免后第10与20 d以相同的免疫操作方式进行三免和四免，第四次免疫后第3 d后尾静脉采血收集血清备用。

1.5 引物设计与EP153R基因扩增 以pET32a-EP153R质粒为模板，设计EP153R基因扩增引物BamHⅠ-EP153R-F：5'-CGCGGATCCG ATGTTCAGCAACAAGAAGT-3'，(下划线部分为BamHⅠ酶切位点)，XhoⅠ-EP153R-R：5'-CC GCTCGAGTTACTTGCTGCAGATGT-3'，（下划线部分为XhoⅠ酶切位点），通用引物M13F（-47）、M13R（-48），上述引物委托上海擎科生物公司合成。PCR反应程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；57℃退火30 s；72℃延伸90 s，共30个循环；72℃再延伸10 min，16℃保存。所得PCR产物用1%琼脂糖进行电泳检测后，目的片段用OMEGA凝胶回收试剂盒回收。

1.6 重组转移质粒pFastBac-EP153R的构建与鉴定分别用1 μL BamHⅠ和XhoⅠ在37℃条件下双酶切pFastBac-1和EP153R基因片段4 h，后续试验方法参考已发表文献[17]。

1.7 重组质粒Bacmid-EP153R的获得 试验方法参考已发表文献[17]。

1.8 重组杆状病毒的拯救与传代 利用Cellfectin™Ⅱ Reagent昆虫细胞转染试剂将重组穿梭质粒Bacmid-EP153R转染至Sf9昆虫细胞系，27℃恒温培养96 h，待细胞体积肿大出现明显病变后，经冻融裂解后离心获取上清，其为P1代重组杆状病毒，命名为rBac-EP153R，将P1代重组杆状病毒盲传至P3代，鉴定重组杆状病毒。

1.9 EP153R蛋白在Sf9细胞中的表达与鉴定

1.9.1 PCR鉴定 取受感染Sf9的细胞裂解后上清液适量，参照DNA病毒基因组提取试剂盒说明书，提取P3代病毒基因组，利用EP153R基因的特异性引物，按照1.5所述的PCR参数进行鉴定。

1.9.2 Western blot鉴定 收集6孔板中的P3代病毒上清液和离心后的细胞沉淀，小鼠多克隆抗体血清以1∶200用3% BSA稀释后备用，HRP标记兔抗鼠IgG以1∶8000用3% BSA稀释后备用，后续按照常规Western blot操作步骤进行试验。

1.9.3 间接免疫荧光（Immunofluorescence assay, IFA）鉴定 试验方法参考已发表文献[16-17]。

1.10 ASFV rEP153R间接ELISA方法的建立

1.10.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定 利用BCA（Bicinchoninic Acid）法测定裂解后Sf9细胞上清液蛋白浓度，利用抗原稀释液将其分别稀释至20、10、5、2.5 μg/mL，以每孔100 μL的量加入96孔酶标板，4℃进行过夜包被；使用前用PBST清洗3次，每次5 min，清洗完毕后用3%脱脂奶粉37℃封闭2 h；将ASFV标准阳性和阴性血清分别以1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000稀释，每孔100 μL，37℃孵育1 h，PBST清洗3次，将羊抗猪IgG-HRP二抗稀释至1∶5000（100 μL/孔）后加入孔中，37℃孵育40 min，PBST清洗5次，加入TMB（100 μL/孔）室温避光显色15～20 min后，加入终止液（50 μL/孔）终止后，立即用酶标仪在OD450读数，根据P/N值筛选出最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数。

1.10.2 阳性临界值的确定 利用60份经ID.vet公司生产的非洲猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒检测为阴性的猪血清，按照优化后的ELISA方法进行试验；计算60份ASFV阴性血清样本OD450平均值与标准偏差，参照文献[8]建立的非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA方法中阳性临界值的确定标准，以阳性临界值（OD450）=平均值（）+5×标准偏差（SD）为条件进行ASFV阴性、阳性血清判定。

1.10.3 灵敏度试验 以优化后的间接ELISA方法为标准，将ASFV阴、阳性血清以1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800、1∶25 600稀释后进行检测，依据结果判定能检测到ASFV阳性血清最大稀释倍数，来检验所建立的间接ELISA方法灵敏度。

1.10.4 特异性试验 用优化后的检测方法对伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea, PEDV）和ASFV阳性血清进行检测，以商品化试剂盒中的ASFV标准阳性与标准阴性血清为对照，进而评估本研究建立的ELISA方法的特异性。

1.10.5 重复性试验 利用优化的ELISA检测方法进行批内和批间重复性试验，用同一批次和四个不同批次抗原包被的酶标板检测6份血清，每份血清4个重复，测定OD450值后计算同一样品OD值变异系数，以评价本ELISA方法的重复性。

1.10.6 符合率试验 收集46份猪血清，利用本试验建立的ELISA检测方法与ID.vet公司生产的ASFV竞争ELISA抗体检测试剂盒进行检测结果对比，计算符合率。

2 结果

2.1 EP153R基因的扩增 以质粒pET32a-EP153R为模板，利用EP153R特异性引物，按照1.5方法进行PCR扩增。1%DNA凝胶电泳后，结果显示，EP153R基因大小为477 bp（图1），与预期结果相符合。

图1 从pET32a-EP153R中扩增EP153R基因片段Fig.1 The EP153R gene fragment was amplified from pET32a-EP153R

2.2 PCR鉴定重组穿梭质粒Bacmid-EP153R 将测序鉴定成功的pFastBac-EP153R质粒转化DH10 Bac感受态细胞，涂板后经过三轮蓝白斑筛选，取白色菌落扩大培养后提取质粒，利用M13通用引物和EP153R基因特异性引物进行PCR扩增，电泳获得大小约为477 bp和2777 bp的条带（图2），与预期相符。

图2 重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-EP153R的鉴定Fig.2 Identification of recombinant baculovirus plasmid Bacmid-EP153R

2.3 PCR鉴定重组杆状病毒 提取P3代rBac-EP153R基因组，利用EP153R基因特异性引物进行检测，在477 bp左右检测到特异性条带（图3），符合预期结果。证明EP153R基因成功与杆状病毒发生同源重组并且感染了Sf9细胞。

图3 从rBac-EP153R中扩增EP153R基因片段Fig. 3 amplification of EP153R gene fragment from rBac-EP153R

2.4 rEP153R蛋白的Western blot鉴定 取适量P2代重组杆状病毒rBac-EP153R感染Sf9细胞，在96 h后收取细胞上清液与细胞沉淀，使用制备的rEP153R小鼠多克隆血清作为一抗，以1∶200稀释后，按照常规Western blot步骤进行检测。结果显示，与正常Sf9沉淀相比，感染rBac-EP153R细胞上清液检测不到rEP153R条带，沉淀可以检测到不同程度糖基化修饰的rEP153R条带（图4）。这说明昆虫细胞-杆状病毒表达系统可以表达rEP153R蛋白，并且可以与rEP153R小鼠多克隆抗体血清发生特异性反应，具有良好的免疫原性。

图4 rBac-EP153R免疫反应Fig.4 rBac-EP153R reactivity was detected by Mouse polyclonal serum

2.5 rEP153R蛋白的IFA鉴定 用P2代重组杆状病毒rBac-EP153R感染96孔板中的Sf9细胞，27℃恒温培养72 h后，观察到细胞发生明显病变，说明感染成功（图5）。4%多聚甲醛固定后3%BSA封闭1 h，用稀释100倍的小鼠多克隆抗体孵育40 min，以FITC标记的兔抗鼠IgG的二抗孵育40 min，荧光显微镜观察EP153R蛋白在Sf9细胞中的表达情况。结果显示，rBac-EP153R感染的Sf9可以显示出明显的绿色荧光信号，这表明rBac-EP153R可以在Sf9中表达rEP153R（图6）。

图5 重组杆状病毒rBac-EP153R感染Sf9细胞（20×）Fig.5 Sf9 cells infected with recombinant baculovirus rBac-EP153R (20×)

图6 IFA鉴定重组杆状病毒rBac-EP153R的表达（10×）Fig.6 IFA identification of recombinant baculovirus rBac-EP153R expression (10×)

2.6 确定最佳抗原包被量和血清稀释比 经方阵滴定试验，结果显示，抗原包被浓度为2.5 μg/mL，血清稀释倍数为1∶1000，此时P/N值最大（表1），为最佳试验条件。

表1 不同血清稀释度光密度值（OD450）Table 1 optical density values of different serum dilutions (OD450)

2.7 阳性临界值的确定 利用ID.vet公司生产的非洲猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒检测收集到的猪血清，筛选出60份阴性样本，利用本ELISA方法进行阳性临界值的确定，样本OD450平均值（x）为0.129，标准偏差为（SD）为0.026（图7），根据阳性临界值（OD450）=+5×SD为判定标准[8]，结果显示，阳性临界值为0.259，此时，样本P/N值大于2，所以判定标准为：待检血清样本OD450>0.259，且P/N>2时，判定为ASFV阳性；OD450≤0.259，且P/N值≤2时，判定为抗体阴性。

图7 临界值确定结果Fig.7 Cut-off value determination result

2.8 特异性试验 用优化后的ELISA方法对PRV、PRRSV、PEDV和ASFV临床阳性血清，以及ASFV标准阴、阳性血清进行检测，结果显示PRV、PRRSV、PEDV血清OD值均小于0.259，判定结果均为阴性（图8），表明该方法特异性良好。

图8 特异性试验结果Fig.8 Specificity test results

2.9 灵敏度试验 用优化后的ELISA方法对倍比稀释后的ASFV标准阴、阳性血清进行检测，结果显示，当ASFV阳性血清3200倍稀释时，P/N值仍然大于2（表2），说明本试验建立的间接ELISA方法具有良好的灵敏性。

表2 灵敏度试验结果Table 2 sensitivity test results

2.10 重复性试验 利用本试验建立的间接ELISA检测方法，选取6份猪血清进行批内和批间重复性试验，分析后结果显示，批内与批间变异系数均小于10%（表3）。说明本试验建立的间接ELISA方法具有良好的重复性。

表3 重复性试验结果Table 3 Repeatability test results

2.11 符合率试验 对收集的46份猪血清进行编号，利用本试验建立的ELISA检测方法与ID.vet的ASFV竞争ELISA抗体检测试剂盒进行检测结果对比，结果显示符合率为91.3%（表4），说明本试验建立的ELISA方法能较好得区分ASFV阴性、阳性血清。

表4 临床样本检测Table 4 clinical sample test

3 讨论

ASFV是一种烈性传染病，从2018年进入中国开始，便对中国养殖业造成了重大的打击，截止目前尚无有效疫苗用于免疫预防，因此，对ASFV的早期检测与诊断便是阻止其流行与暴发的关键措施[2]。结合当前国内ASFV疫情状况，我们需要尽快建立实时荧光定量PCR、多重反转录PCR、ELISA等高灵敏度检测方法来初步应对ASFV带来的威胁，前两者由于需要专业的设备，一般仅限于实验室诊断，ELISA检测方法灵敏度虽然低于PCR，但是相对来说成本廉价，操作简单，适用于短时间内的大规模初步筛查[18]。

目前研究结果显示，ASFV特异性抗体检测所用的靶蛋白有p72蛋白、p54蛋白、p30蛋白、pp62蛋白以及CD2v蛋白等，p72蛋白是ASFV晚期表达的结构蛋白，保守型强，免疫原性好，是目前研究较为成熟的ASFV检测靶标之一，Heimerman等[19]利用杆状病毒表达系统表达了p72蛋白截短体，制备了可以识别p72蛋白的单克隆抗体，为开发ASFV血清学检测方法提供了新思路；p54蛋白也是ASFV的一种结构蛋白，曹琛福等[20]基于原核表达的 p54蛋白建立了一种竞争ELISA检测方法，与商品化试剂盒检测结果相比符合率为98.13%；p30蛋白能够抑制ASFV内化，徐黎晖等[21]以杆状病毒表达系统表达的p30蛋白为免疫原，建立了ASFV抗体间接ELISA检测方法，特异性良好；pp62蛋白在病毒粒子成熟过程中被S273R蛋白酶切割为p35、p15和p8三种蛋白，其中p15是主要产生抗原性的蛋白，Callarod等[22]利用杆状病毒表达系统表达了pp62重组蛋白，以此建立的ELISA检测方法在敏感性与特异性上优于OIE推荐的方法；CD2v蛋白会导致猪红细胞吸附，蒋智勇等[23]利用CHO-K1细胞表达了CD2v蛋白并建立了一种间接ELISA抗体检测方法，该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性。根据不同ASFV蛋白抗原所建立的ELISA方法各有特点，为了达到更快、更灵敏、更准确的检测结果，便需要不断挖掘ASFV中其他可用于特异性抗体检测的病毒蛋白，还需要选择不同抗原组合进行下一步试验完善ELISA检测方法。

EP153R是一种C型凝集素蛋白，蛋白内存在多个N-糖基化，磷酸化等修饰位点，在AFSV感染过程中持续表达且可被检测到，因此猜测其可以作为一种ASFV特异性抗体检测的靶蛋白，本实验室此前已经证明EP153R可以在大肠杆菌表达系统中稳定表达[16]，但是原核系统表达的EP153R蛋白未经修饰，在反应原性上可能会弱于真核系统表达的蛋白，而杆状病毒表达系统兼具原核和真核表达系统的优势，在高效、大量表达目的蛋白的同时，还可以进行一定程度的翻译后修饰。因此本试验将人源优化后的EP153R基因克隆至pFastBac1载体中，测序鉴定成功后将重组载体pFastBac1-EP153R转座至DH10Bac感受态细胞，之后进行蓝白斑筛选，将提取的重组杆粒Bacmid-EP153R转染至Sf9细胞中，待细胞出现病变后收获细胞上清，在Sf9细胞中盲传3代后获得重组杆状病毒rBac-EP153R，并利用Western blot与IFA检验rEP153R蛋白的表达与免疫原性，结果显示，本试验构建的EP153R杆状病毒表达系统可以高效表达N-糖基化修饰后rEP153R蛋白，且具有良好的免疫原应。因此，本试验进一步以杆状病毒表达的rEP153R蛋白为包被原，通过ELISA方阵滴定试验确定了当抗原包被浓度为2.5 μg/mL，ASFV阳性稀释度1∶1000时为最佳反应条件，以此试验条件进行间接ELISA方法的建立，利用60份ASFV阴性血清确定了抗体阳性临界值为0.259，特异性结果显示该ELISA方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应，且当阳性血清稀释度为1∶3200时仍能检出，说明该方法灵敏性良好；批内和批间的重复性试验结果显示，变异系数均小于10%，具有良好的重复性；利用本方法对46份ASFV临床血清样本与ASFV商品化ELISA检测试剂盒进行符合率试验，结果显示该方法检出ASFV阴、阳性血清与商品化试剂盒对比符合率为91.3%，可以用于ASFV抗体检测。

本研究成功构建EP153R杆状病毒表达系统，且建立了基于rEP153R蛋白的间接ELISA检测方法，为ASFV特异性抗体检测靶标提供了一名新成员，但是还需大量的、不同来源的猪血清进一步验证来扩充实验数据，完善该检测方法，为研发快速、灵敏、准确且安全的ASFV间接ELISA法检测试剂盒提供参考，也为ASFV的监测与防范提供技术储备。