LAMP-LFD技术在检测猪圆环病毒3型中的应用研究

王 妍，时建立，彭 喆，吴晓燕，王 硕，孙盼盼，徐绍建，韩先杰，李 俊,

（1.青岛农业大学动物医学院，青岛 266000；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100；3.山东师范大学生命科学学院，济南 250014）

猪圆环病毒（porcine circovirus, PCV）是现今已知的可以感染哺乳动物的最小病毒，是一种单链环状、大小1700 bp的DNA病毒。目前已发现猪圆环病毒拥有三个基因型：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1感染猪后不引起任何临床症状[1]；PCV2感染猪后则会引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（post weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）、皮炎性肾病、渐进性消瘦、生长发育不良等多种临床症状复杂的疫病；PCV3是一种从猪体内鉴定的新亚型，其致病机制尚不明确。PCV3多从出现皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS）的母猪或仔猪中分离得到，检测到PCV3的患病猪的PCV2检测为多阴性[2-3]。2017年，我国南部地区首次报道了PCV3的出现[4]。

通过ELISA、PCR等方法发现，我国PCV3的感染率在猪场中上升且感染范围越来越大，虽然现在对PCV3的临床症状尚不明确，但是PCV3确实是引起了组织炎症，并且在呼吸系统疾病、腹泻、高热病猪中检出率很高，PCV3侵入机体后是否对机体免疫产生了破坏性还需要通过研究其致病机制得知。由于PCV3阳性猪越来越多，建立快速检测PCV3方法已成为目前亟待解决的问题。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是核酸体外扩增技术[5]，其反应过程始终维持在恒定的温度下，利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。与PCR技术相比，LAMP技术对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。

侧向流动试纸条（lateral flow dipstick, LFD）技术的基础是Sano等[6]在1992年建立的检测微量抗原的高灵敏度技术。LFD法是利用含有生物素（Biotin）标记的扩增产物能与异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的探针特异性杂交，从而与胶体金标记的抗FITC的抗体结合形成三元复合物，结合在含生物素抗体的检测线上，而未杂交的FITC标记探针形成不含生物素的两元复合物，结合在含抗FITC的质控线上[7]。当质控线与检测线同时出现在检测试纸条上时，说明样本为阳性。LAMP-LFD技术将LAMP产物在侧向流动试纸条上以显色的方式呈现，通过肉眼观察可完成结果判断。该方法摆脱了对于仪器的依赖性，摒弃了有毒试剂，加之特异性探针的引入，使得结果更加特异，而且整个检测时程也仅在LAMP反应的基础上增加了8～10 min。

本研究将LAMP与LFD相结合，建立了快速检测PCV3 LAMP-LFD方法，并对该方法的特异性、灵敏性以及临床初步应用进行了验证分析。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸 猪圆环3型病毒核酸及质粒、猪圆环1/2型病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV）、猪瘟病毒（Swine fever virus, SFV）、伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）等由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存。临床试验所用100份样本采自烟台、临沂、聊城等地的养殖场。

1.2 LAMP相关引物及杂交探针设计 参照NCBI上传的PCV3相关保守序列（GenBank登录号：MH107164.1），利用LAMP引物在线设计网站（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html），设计出一组用LAMP引物，包括上游外引物F3：（5'-TCCAGTTTTTTCCGGGACAT-3'）、下游外引物B3：（5'-AACACTTGGCTCCAAGACG-3'）、上游内引物FIP：（F1C-F2：5'-CTTTTTCTCCAGA CCCACCCCA-AAAGCAGTGCTCCCCATTG-3'），以及下游内引物BIP（B1C-B2：5'-TTCCCGCCAGAA TTGGTTTCGG-GCGGAAAGTTCCACTCGTAA-3'），如图1所示。根据目标扩增片段，利用Primer Premier 5.0设计出多条探针以便筛选，如表1所示。将引物及杂交探针交由宝生物工程（大连）有限公司合成并进行修饰，FIP 5'端修饰生物素（Biotin），杂交探针5'端修饰异硫氰酸荧光素（FITC）。

图1 引物位置Fig.1 Primer position

表1 杂交探针Table 1 Hybrid probe

1.3 常规PCR方法 以外引物F3/B3作为常规PCR上、下游引物扩增目的条带，大小为230 bp。按照南京诺唯赞生物科技有限公司2×TaqPlus Master MixⅡ说明书配制PCR反应体系（20.0 μL）为：2×TaqPlus Master MixⅡ 10.0 μL；上、下游引物B3 1.0 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 6.5 μL。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，57℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环；72℃延伸8 min。反应结束后将产物4℃保存，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察结果。

1.4 LAMP体系建立及条件优化 利用质粒小提试剂盒提取PCV3阳性质粒作为DNA模板，按照NewEngland Biolabs公司的Bst2.0 DNA聚合酶说明书配制25.0 μL的LAMP体系：10× ThermoPol®Buffer 2.5 μL，100 mmol/L MgSO41.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 5.0 μL，Betaine 2.0 μL，10 mmol/L F3/B3 0.25 μL，10 mmol/L FIP/BIP，1.0 μL，8000 U/mLBstDNA Polymerase 1.5 μL，DNA模板1.5 μL，补足Nuclease-free ddH2O至25.0 μL。以60℃水浴条件进行最优反应时间探索试验，每5 min为一个梯度分别设置35、40、45、50、55、60、70 、75 min反应时间。选定LAMP反应时间后，进行最优反应温度探索试验，1℃为一个梯度分别设置56℃～64℃反应温度。根据琼脂糖凝胶电泳实验结果可观察到梯形条带，根据条带的清晰度及亮度确定最优反应时间温度，以期在实际应用过程中快速便捷获得实验结果。

1.5 LAMP-LFD检测 LFD试验所用试纸条购自Milenia Biotec GmbH，LAMP反应结束后，加入2 μL杂交探针继续反应5～6 min，继而取出5 μL产物加入到100 μL HybriDetect Assay Buffer中等待1～2 min后放入侧向流动检测试纸条等待检测结果。

1.6 LAMP-LFD检测的特异性及灵敏性试验 在优化后的条件下，分别用PCV1、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV与PCV3为模板同时进行LAMP-LFD特异性试验。在优化后的条件下，将PCV3阳性质粒10倍倍比稀释（初始浓度为200 ng/μL）进行常规PCR及LAMP-LFD灵敏性试验。

1.7 LAMP-LFD检测的重复性以及在临床方面的应用 在得到灵敏性试验的结果后，使用最低检测浓度的稀释质粒进行重复性试验。利用常规PCR及LAMP-LFD方法对来自山东省烟台市、临沂市、聊城市等地的100份疑似患病猪组织进行检测，以此评估LAMP-LFD方法在临床检测上的适用性。

2 结果

2.1 LAMP-LFD检测及杂交探针筛选 经试验探究，观察琼脂糖凝胶电泳结果可判断在反应时间为50 min，反应温度为62℃时，梯形条带变亮变清晰并且剩余组别的亮度无差异，表明PCV3 LAMP最佳反应时间、温度分别为50 min、62℃（图2），使用最优反应条件进行杂交探针的筛选，结果显示Probe 1及Probe A的杂交效果优于其他（图3），选用Probe 1。

图2 试验时间温度优化Fig.2 Experimental condition optimization

图3 杂交探针的筛选Fig.3 Screening hybridization probe

2.2 特异性与灵敏性试验 LAMP引物只能扩增PCV3，与其余病毒核酸均不产生反应，证明其特异性好（图4、图5）。灵敏性试验显示，常规PCR方法在核酸稀释梯度为10-6时条带已模糊不清（此梯度浓度为0.2 pg/μL）（图6），而LAMP-LFD方法在稀释梯度为10-9时仍可观察到清晰检测线（此梯度浓度为0.2 fg/μL）（图7），说明LAMP-LFD检测体系比常规PCR方法灵敏近1000倍。

图4 特异性试验Fig. 4 Specificity test

图5 特异性试验Fig. 5 Specificity test

图6 常规PCR方法的灵敏性试验Fig.6 Sensitivity test using conventional PCR method

图7 LAMP-LFD方法的灵敏性试验Fig.7 Sensitivity test using LAMP-LFD method

2.3 重复性试验及LAMP-LFD方法的临床应用 重复性试验结果显示（图8），除第三次试验质粒浓度较低组分的检测线不够清晰外，其余四次试验均能观察到清晰的检测线与质控线。说明即便是在核酸浓度较低的情况下LAMP-LFD检测技术仍能拥有极高的重复性。

图8 重复性试验Fig.8 Repeatability test

利用常规PCR及LAMP-LFD方法对100份样品进行PCV3检测，使用常规PCR法PCV3的检出率为83%（83/100），部分样品结果，见图9，而使用LAMP-LFD方法时PCV3的检出率为87%（87/100），部分样品结果，见图10，且使用常规PCR方法检测出的阳性样品都通过LAMP-LFD方法检测出。

图9 常规PCR方法对临床样本的检测Fig.9 Detection of clinical samples by conventional PCR method

图10 LAMP-LFD方法对临床样本的检测Fig.10 Detection of clinical samples by LAMP-LFD method

3 讨论

PCV3作为近几年新发现的病毒亚型，由于分离培养毒株技术不够成熟，暂时并未发现会给感染猪群带来明显临床症状，但仍有研究报道表示在出现严重腹泻[8]、呼吸道疾病[9]等猪群中检出PCV3的几率更高。自2016年Palinski等[2]发现并报道PCV3，各国相继检测并报道。2017年，在我国南方首次发现PCV3阳性感染猪，同年，山东省也首次发现猪群感染PCV3[10-11]。感染猪未出现相应的临床症状，但可以从组织切片观察到炎症反应。我国自报道检测出PCV3以来，通过ELISA方法检测抗体[12]，以及PCR[9]等方法检测抗原发现我国各地猪群中的PCV3阳性率偏高，说明猪群感染PCV3的情况已非常严重且范围越来越广，必须加以重视。

LAMP作为一种操作简单快捷的核酸扩增方法，近些年以来使用频率变高，但由于LAMP结果的可视化效果相较于LAMP操作本身来说过于复杂，LAMP产物的判定方法有琼脂糖凝胶电实验、浊度仪或使用荧光染料观察颜色变化，这些判定方法有一定的缺陷，而LAMP-LFD实验刚好可以提高检测结果的可视化效果，使得实验简单易行。LAMP-LFD技术常被用来检测猪瘟病毒和各类细菌等[13-15]，而本实验则是首次将LAMP-LFD方法引入到检测PCV3中。本实验研究结果表明，LAMPLFD方法的灵敏度明显高于常规PCR方法，并得到了较好的结果；具有较高的重复性，可用于临床快速检测；在临床试验中，LAMP-LFD方法的检出率略高于常规PCR方法，同时，LAMP-LFD方法也检测出常规PCR方法未检出的阳性样品。以上结果可以看出LAMP-LFD方法在临床检测中更有优势，且LAMP-LFD方法不需要接触有毒试剂，也不需要昂贵仪器，得出结果的时间也较短，在实际生产应用中这些优点会给养殖单位带来极大的便利。