裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

孙 潇 ，张艳芳 ，叶 静 ，曹胜波 ，陈 政

（1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070）

裂谷热（rift valley fever, RVF）是由裂谷热病毒（Rift valley fever virus, RVFV）感染引起的一种危害严重的人兽共患传染病，可导致反刍动物的大量死亡及人类的致命性出血热。RVFV属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）白蛉热病毒属（Phlebovirus），主要经蚊媒传播。裂谷热首次报道于1912年的肯尼亚，其最初仅流行于非洲东部地区[1]，但1950年之后，该病开始沿撒哈拉沙漠向周边国家蔓延[2]。2000年，裂谷热疫情扩散至亚欧大陆，沙特阿拉伯和也门相继暴发该病[3]。之后，裂谷热疫情流行至西亚地区，并对周边的非流行国家造成严重威胁。近年来，伴随进出口贸易的增加、国际交流的日益频繁，裂谷热的流行区域已在全球范围逐步扩大。2016年，我国确诊了首例输入性裂谷热病例，并引发了社会的高度关注[4]。

裂谷热是世界动物卫生组织列定的A类传染病，其宿主范围广，对畜牧业生产危害严重。牛、山羊和绵阳是RVFV的最易感宿主，羔羊和犊牛感染后的死亡率可高达90%，妊娠牛羊感染后胎儿死亡率接近100%[5]。感染RVFV后的动物主要表现为精神不振、厌食症、腹泻、流鼻血和黄疸等，并伴发肝脏、胃、小肠等多器官的出血坏死[6]。人对RVFV也易感，一般主要通过处理感染性材料接触或通过蚊虫媒介叮咬而感染。患者一般表现为出血热并伴发非特异性流感样症状。当患者出现严重肝脏损伤或神经系统并发症时，死亡率可高达50%[7]。目前，裂谷热尚无特定治疗方法，及早诊断及免疫预防是控制该病最有效方法。

RVFV为单股分节段负链RNA病毒，由L、M、S 3个节段组成，其中L节段编码核酸内切酶和RNA依赖的RNA聚合酶；M节段主要编码前体囊膜糖蛋白G；S节段主要编码核衣壳蛋白N及非结构蛋白NSs[8-9]。RVFV囊膜蛋白G在翻译后修饰过程中裂解为Gn蛋白和Gc蛋白，二者均为RVFV的主要抗原蛋白，其中，Gn蛋白可诱导宿主产生中和抗体，因而可作为研究RVF基因工程疫苗的重要靶蛋白[10]。本研究选取Gn蛋白主要抗原区Gn1，利用杆状病毒表达系统构建表达Gn1蛋白的重组杆状病毒，并在昆虫细胞中表达和纯化Gn1蛋白，以期为RVF亚单位疫苗及诊断试剂的研发提供重要材料。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒 Gn1质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成构建；转移载体pFastBac HTB（HTB）、感受态细胞DH10Bac、Sf9、High5细胞由本实验保存。

1.2 主要试剂 DNA聚合酶、DNA marker、BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶购自ABclonal公司；T4连接酶购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、蛋白marker购自天根生化科技(北京)有限公司；LipofectamineTM3000、MTS购自Invitrogen公司；Grace基础培养基（粉末）购自GIBCO公司；Sf9无血清培养基购自HyClone公司。

1.3 引物设计与合成 RVFV Gn基因片段全长1610 bp，不易进行表达和纯化。本研究根据RVFV M片段序列（GenBank登录号：DQ380206）、G蛋白主要抗原区的相关报道，并结合DNAStar软件分析Gn蛋白的亲水区及主要抗原区，确定选取亲水性较强、暴露率较高的主要抗原区Gn 1进行引物设计。根据选取的RVFV Gn1基因的核苷酸序列和载体pFastBac HTB图谱设计两对引物。引物设计时，在上游引物中加入蜂素信号肽序列（5'-ATGAAATTCTTAGTC AACGTTGCCCTTGTTTTATGG-3'），分别扩增不含信号肽序列RVFV Gn1基因以及含有信号肽序列的RVFV Gn1-F基因。同时，参照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书，设计鉴定DH10bac杆粒的通用引物M13引物。以上引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

1.4 重组转移载体构建 以合成的RVFV Gn1质粒为模板分别扩增包含蜂素信号肽序列和不包含蜂素信号肽序列的Gn1基因片段，将扩增的片段（带蜂素信号肽序列850 bp左右，不带蜂素信号肽序列800 bp左右）用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB（4856 bp）中（图1），经酶切及测序鉴定，获得两个重组质粒pFastBac HTB-RVFV-F-Gn1及pFastBac HTB-RVFV-Gn1。

图1 pFastBac HTB-RVFV-F-Gn1及pFastBac HTB-RVFV-Gn1质粒构建示意图Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction of pFastBac HTB-RVFV-F-Gn1 and pFastBac HTB-RVFV-Gn1

表 1 寡核苷酸引物序列Table 1 Sequence of O ligonucleotide Primers

1.5 重组杆状病毒杆粒构建 将构建成功的重组质粒HTB-RVFV-F-Gn1及pFastBac HTB-RVFV-Gn1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，同时 将未插入外源基因的质粒pFastBac HTB转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞作为阴性对照。经多重蓝白斑筛选，获取阳性重组菌株，提取杆粒并进行PCR鉴定，正确后命名为rBacmid-HTB-RVFV-F-Gn1及rBacmid-HTB-RVFV-Gn1。

1.6 重组杆状病毒的制备和鉴定 将生长状态良好的Sf9细胞分别均匀接种6孔和24孔细胞板，按照LipofectamineTM3000说明书操作方法，将上述杆粒转染至其中，24孔板细胞同时转染实验室已验证成功的CMV-JEV-NS5真核质粒作为阳性对照。将转染后的细胞置于28℃继续培养72 h，当转染细胞出现明显细胞病变（cytopathogenic effects, CPE）后，离心收集6孔板细胞上清液，上清液即为P1代重组病毒。24孔板细胞，一部分去上清液固定，使用His一抗进行IFA鉴定，剩下的细胞分别收集细胞培养基上清液、细胞裂解上清液、细胞裂解沉淀进行SDS-PAGE和Western blot分析。

1.7 重组杆状病毒的扩增 使用前述IFA和Western blot均已验证成功表达蛋白的P1代重组杆状病毒接毒于Sf9细胞进行传代增殖，培养72～120 h待细胞发生明显病变后收取上清液获得毒力更强的P2代病毒，同样的传代方法获得P3代毒。获取的病毒使用半数组织培养感染剂量（median tissue culture infective dose,TCID50）方法测定毒价后分装冻存于-80℃冰箱。

1.8 重组蛋白的表达纯化 使用能够更高效表达外源蛋白的High5细胞，感染不同剂量的P3代杆状病毒培养至不同时间点，摸索重组杆状病毒最优表达条件。在最优表达条件下，大量培养High5细胞，收集细胞上清液或细胞裂解上清液，0.22 μm滤器过滤，然后用纯化仪纯化，并使用10 kDa超滤管浓缩，最终获得浓度较高的纯化蛋白。

2 结果

2.1 目的基因扩增与重组质粒构建以RVFVGn1质粒为模板，分别扩增带蜂素信号肽序列的Gn1片段和不带蜂素信号肽序列的Gn1片段，扩增产物经电泳分析，可见约为850 bp（图2A）和800 bp的目的条带（图2B）。将扩增产物克隆至pFastBac HTB载体，经酶切鉴定（图3）并测序，结果与预期相符，表明Gn1重组转移载体构建成功。

图2 RVFV-Gn1（A）及RVFV-F-Gn1（B）基因 PCR 扩增图Fig.2 PCR Amplification for RVFV-Gn1 (A) and RVFV-F-Gn1 (B)

图3 重组质粒pFastBac HTB-RVFV-Gn1（A）和pFastBac HTB-RVFV-F-Gn1（B）的酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmids pFastBac HTB-RVFV-Gn1 (A) and pFastBac HTB-RVFV-F-Gn1 by restriction enzyme digestion (B)

2.2 重组杆粒的构建及鉴定 以提取的重组杆粒为模板进行PCR，使用M13通用引物进行PCR，结果如图4所示，由M13上、下游引物扩增可见一条清晰的目的条带，条带均约为3000 bp，大小与理论相符，证明重组杆粒rBacmid-HTB-RVFV-F-Gn1及rBacmid-HTB-RVFV-Gn1构建成功。

图4 重组穿梭质粒的鉴定结果Fig.4 PCR identification of the recombinant bacmid plasmid

2.3 重组杆状病毒在Sf9细胞中表达Gn1蛋白检测 将鉴定成功的重组杆粒及CMV-JEV-NS5真核表达质粒同时转染Sf9细胞，72 h后可观察到转染杆粒后的Sf9细胞出现了明显的细胞病变。对细胞进行固定处理，使用His一抗进行间接免疫荧光检测，可见转染了rBacmid-HTB-RVFV-F-Gn1及rBacmid-HTB-RVFV-Gn1杆粒的细胞出现了与阳性对照类似的特异性荧光，并且转染rBacmid-HTBRVFV-Gn1杆粒的细胞荧光更强，而转染了空杆粒的阴性对照组没有出现荧光（图5）。收集转染rBacmid-HTB-RVFV-Gn1杆粒的细胞培养上清液、细胞裂解上清液和细胞裂解沉淀进行SDS-PAGE及Western blot分析，可以看到在细胞裂解上清样和细胞裂解沉淀样泳道出现了符合预期大小36 kDa的条带（图6），证明重组杆状病毒在Sf9细胞中成功表达出Gn1蛋白。

2.4 重组杆状病毒制备与扩增 6孔板Sf9细胞转染rBacmid-HTB-RVFV-Gn1杆粒72 h后，待细胞出现明显病变后收集细胞上清液，获得P1代重组杆状病毒。将此重组病毒感染Sf9细胞进行传代增殖至第三代，P3代重组毒可观察到明显细胞病变现象，细胞生长缓慢，开始膨大、裂解、脱落（图7）。

图7 重组杆状病毒 rBacmid-RVFV-Gn1的细胞病变效应Fig.7 Cytopathic effect of recombinant baculovirus rBacmid-RVFV-Gn1

2.5 重组Gn1蛋白的大量表达纯化 使用能够更高效表达外源蛋白的High5细胞接种6孔细胞板，分别感染1 MOI、2 MOI和3 MOI重组杆状病毒，感染后48 h和72 h收集细胞，细胞裂解上清液经Western blot分析显示，接毒量1 MOI，感染时间72 h为重组杆状病毒感染细胞后蛋白表达的最优条件（图8）。在此最优条件下，大量收集细胞裂解上清液，过滤纯化并浓缩，最终产物经SDS-PAGE及Western blot分析，特异性反应的蛋白条带大小符合预期，且纯化效果较好（图9）。

图8 重组杆状病感染细胞蛋白最优表达条件Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of optimum expression condition of rBacmid baculovirus infection

图9 rBacmid-RVFV-Gn1 SDS-PAGE和Western blot结果Fig.9 SDS-PAGE and Western blot analysis of rBacmid-RVFV-Gn1

3 讨论

RVF是由RVFV感染引起的一种严重威胁全球动物和人类健康的烈性传染病[7]，但目前针对该病尚无商品化的疫苗。RVFV Gn蛋白可刺激宿主产生中和抗体，是研究RVF基因工程亚单位疫苗的重要结构蛋白。杆状病毒表达系统是目前最常用的真核表达系统之一，其能够高水平地保真蛋白原本结构及功能特点，维持蛋白的生物活性，在病毒亚单位疫苗研究方面具有显著优势。基于此，本研究以RVFV Gn蛋白的截短体Gn1蛋白（Gn的主要抗原区）为研究对象，将其克隆至杆状病毒载体构建重组杆状病毒，最终成功在杆状病毒表达系统中表达出rGn1蛋白，为RVF诊断试剂盒及亚单位疫苗的研发提供了物质基础。

Gn基因全长1610 bp，考虑到Gn蛋白较大，为方便后期克隆及表达，本研究选择了RVFV Gn蛋白的主要抗原表位区域的截短体Gn1进行杆状病毒的构建并在昆虫细胞中表达纯化。实验结果表明rGn1蛋白保留了Gn蛋白的反应原性，并且通过后期与原核表达的rGn1蛋白免疫小鼠血清反应，证明其也有很好的免疫原性。此外，我们还尝试使用不同载体和添加蜂素信号肽的方式，增加重组蛋白被分泌到培养基上清中的可能性。我们选用了pFastBac1（结果未显示）和pFastBac HTB两种载体，但是最终只有pFastBac HTB载体的重组质粒正确表达，并且添加蜂素信号肽对于重组蛋白分泌表达的作用不大。虽然最终的重组蛋白并未大量表达在培养上清液中（主要在细胞裂解上清液和裂解沉淀中），我们通过纯化细胞裂解上清液依然获得了纯度较好的rGn1重组蛋白。但是由于细胞裂解上清液的量较少，获取大量重组纯化蛋白成本较高，后期还需进一步摸索条件，使rGn1蛋白能够在培养上清液中大量表达。

pFastBac HTB载体本身带有6×His标签，为了获取高纯度的rGn1蛋白，我们将最终产物使用His-NI柱亲和层析法进行了纯化。但是单一使用亲和层析方法进行纯化，效果并不是最好，会得到一些杂蛋白。我们的结果也显示纯化后的重组蛋白还是存在少量非目的蛋白，后期还需使用分子筛及离子交换层析对所获得的蛋白进行进一步纯化。