杯状病毒复制酶的结构与功能

刘光清

（中国农业科学院上海兽医研究所）

杯状病毒是一大类能感染人及动物的RNA病毒，其中有很多对人类及动物健康能构成严重威胁的成员。例如，诺如病毒属中的人诺如病毒是引起人病毒性胃肠炎的重要病原之一，全球近一半的肠胃炎病例都可能是由诺如病毒感染引起的[1]。而且这类病毒很容易在人与人之间或通过受污染的食物和水传播，对老年人、年轻人和免疫功能低下的人群威胁更大，人诺如病毒感染已经被认为是一个重大的公共卫生问题。水疱疹病毒属的猫杯状病毒（Feline calicivirus, FCV）和猪疱疹病毒，在动物群体中具有高度传染性，可引起持续性感染。其中，FCV可导致所有猫科动物的发烧、急性上呼吸道感染和口腔疾病，并可导致严重的系统性疾病[2]。兔病毒属中的兔出血性病毒可引起多数品种兔发生急性坏死性肝炎和弥漫性血管内凝血，导致感染后48～72 h死亡。因此，杯状病毒是一类重要的公共卫生病原，它与人及动物的健康密切关联。

1 杯状病毒基因组及其编码蛋白

杯状病毒基因组具有许多共同特征。其基因组由单股正义RNA分子组成，包含两个或多个部分重叠开放阅读框（open reading frames, ORFs）中的编码序列。编码序列在5'端和3'端都有非翻译区域（untranslated region, UTRs）。在基因组RNA的5'端都共价连接一种由病毒自身编码的的连接蛋白（VPg），基因组3'端则都由多聚腺苷酸尾巴（poly(A)），长度不等。杯状病毒颗粒中均含有两种RNA分子，一种是全长约7.5 kb的基因组RNA，另一种是长度约为2.4 kb的亚基因组RNA。杯状病毒的ORFs数量在全长基因组RNA中为2～4个，在亚基因组RNA中为2～3个（图1）。其中，ORF1是最大的阅读框架，其编码的多聚蛋白随后被裂解成至少五种非结构蛋白质和VPg（主要是诺如病毒属、水疱疹病毒属）或五个非结构性蛋白，VPg以及主要衣壳蛋白VP1（主要是兔病毒属、尼博病毒属、沙坡病毒属）[3-4]。诺如病毒基因组RNA中的第2和第3个ORF分别编码结构蛋白VP1和VP2。在水疱疹病毒中，ORF2编码VP1前体蛋白，随后裂解成成熟的VP1和小的前体肽（衣壳蛋白的前体，LC）。FCV的LC蛋白具有细胞病变并促进病毒传播作用[5]。所有杯状病毒的亚基因组RNA都非常相似；它们包含5'UTR、VP1、VP2编码序列[6-8]。在小鼠诺沃克病毒（Murine Norwalk Viruses, MNV）中，在基因组和亚基因组RNA的VP1编码区都有一个额外的ORF编码病毒因子1（virus factor 1, VF1），这是一种先天抗病毒免疫应答的拮抗剂[9]。

图1 杯状病毒基因组及其亚基因组及结构示意图[19]Fig.1 Schematic representations of typical calicivirus genome organizations[19]

来自多肽前体的成熟非结构蛋白包括NS1、NS2、NS3（核苷三磷酸酶，nuclear nucleoside triphosphatase, NTPase）、NS4、NS5（VPg）、NS6（蛋白酶：Pro）、NS7 （RNA依赖RNA聚合酶：RdRp)。NS1、NS2、NS3和NS4的功能仍知之甚少，而VPg、Pro和RdRp的功能已在不断被揭示，为了解杯状病毒的复制提供了重要线索或依据。例如，VPg作为引物参与基因组复制、病毒蛋白翻译和病毒粒子的基因组包装，Pro则负责催化前体多肽的裂解过程。依赖RNA的RNA聚合酶是负责病毒复制的关键蛋白。病毒复制酶（RdRp）在病毒基因组RNA的复制中发挥了核心作用，成熟的RdRp的分子量约为60 kDa（前体蛋白的分子量约为75 kDa）。值得注意的是，杯状病毒RdRp前体蛋白也是一种活性聚合酶[11]。蛋白酶的活性与其晶体结构密切相关，也可以说蛋白酶的结构决定了其催化活性。因此，解析蛋白酶的结构及其与功能之间的关系，也是深入探索病毒复制和翻译的关键环节。作为所有病毒蛋白中最具特征的蛋白酶，杯状病毒家族中的几个典型成员的RdRps结晶结构已经得到解析。

2 复制酶的结构

2.1 复制酶结构的基本特征 RHDV、HuNoV GII.4、NoV GI和SaV GI 复制酶的晶体结构具有显著的结构相似性，即都具有与右手手指、手掌和拇指的结构域相似的特征，具有N端结构域，扩展的N端域桥接在手指和拇指域上。拇指区域的顶端形成一个延伸的环，同一区域的底部构成C末端区域，表现出明显的构象变化。相比之下，手掌区域，即复制酶最保守的区域和手指区域的构象变化相对较小。

杯状病毒RdRp在非对称单元中包含1～2个蛋白质分子，它们之间没有非晶体对称关系，主要表现为单体形式，而MNV RdRp结构中每个非对称单元包含3个分子。MNV RdRp在溶液中为单体，在晶体中为六聚体。MNV RdRp的分子构型与其他RdRp明显不同，MNV RdRp可以形成稳定的球形六聚体。当晶体结构不对称单元中不同的RdRp分子叠加时，在拇指区域相对于手掌区域的位置以及N-或C-末端区域，特别是C-末端区域的位置，会出现很大范围的个体差异，见图2。

图2 杯状病毒复制酶（RdRps）的晶体结构[10]Fig.2 Superimposed structures of calicivirus RNAdependent RNA polymerases (RdRps)

2.2 RdRp的活性区域 迄今，已经确定了7个高度保守的氨基酸序列基序：手掌域的4个基序（基序A、B、C和D）、拇指域的1个基序（基序E）和手指域的2个基序（基序F和G）（图3）[12-13]。其中，B、D、E、F基序参与核苷酸识别和配位，B和G基序参与配位模板和引物结合，A和C基序参与核苷酸结合的催化。A基序中具有两个被5个氨基酸分离的Asp残基，它是RHDV、SaV、HuNoV和MNV RdRps的活性位点，通过介导二价金属离子与RNA或核苷酸的结合，在RNA合成中发挥关键作用。C基序包括一个Asp-Asp双肽，形成高度保守的Gly-Asp-Asp基序。在A和C基序中，Asp残基与两种二价金属离子（通常是Mg2+或Mn2+）配位，这两种金属离子是催化所必需的。F基序包含了Arg和Lys两种带正电的残基，它们介导与进入的三磷酸核苷（NTPs）的三磷酸基团相互作用[14-16]。G基序位于模板间隙，参与RNA复制起始阶段的蛋白质引物定位[17-18]。

RNA和NTP复合物中RdRp的结构揭示了三个关键特征（1）金属离子和NTP底物与活性位点的结合；（2）拇指区中心螺旋的旋转能够结合RNA模板（图3b）；（3）C端尾部从活性位点的位移。拇指区可能介导与RNA的松散相互作用，拇指区中心螺旋的旋转可以扩大活性位点以适应RNA的结合。构象的改变可能促进RNA双链的释放或易位。

图3 杯状病毒RdRp的结构域、基序和同态[19]Fig.3 Domains, motifs, and homomorphs of a typical calicivirus RdRp

2.3 C-和N-末端区域 杯状病毒RdRps构象C端的变化最为显著，其末端螺旋和环位于拇指区底部，靠近活性位点裂隙。在许多RdRp结构中，C端区域是非结构化或部分无序的。RHDV和MNV RdRps表现的最为明显；其C末端区域不可见，仅在拇指区底部可见末端螺旋。相反，SaV和NoV RdRps均显示位于活性位点的C端区域，可以阻断RNA与活性位点的结合（图4）。令人惊讶的是，SaV RdRp的C端环被插入另一个RdRp分子的活性位点，显示了一个活性位点突变结构中的C端交换。C端氨基酸残基在杯状病毒RdRps中序列一致性和结构相似性程度较低。值得注意的是，C末端区域干扰引物RNA进入活性位点间隙，并与引物相互作用，或可能与活性位点附近形成的发夹结构相互作用。因此，C端区域可能在启动RNA复制中发挥作用[20-21]。在RHDV、SaV和HuNoV RdRps中也观察到N端区域的显著构象变异性。在MNV中，一个RdRp分子的N端区域与另一个分子的N端区域非常接近，说明N端区域之间的相互作用可能有助于六聚体RdRps的晶体堆积[22]。

3 RdRp与其它蛋白分子的相互作用

3.1 与病毒蛋白的相互作用 诺如病毒RdRps可以形成同源二聚体[23]，这种现象在小核糖核酸病毒中也存在。当不同数量高浓度重组诺如病毒RdRp蛋白在自然（非变性）条件下经PAGE处理后，可观察到二聚体的形成，而且二聚体的形成似乎具有重要的生物学意义，因为诺瓦克病毒RdRps表现出协同的酶活性。随着RdRp浓度的增加，体外可以合成越来越多的RNA，直到达到平台期。Hogbom通过计算Hill系数来分析RdRp单体之间的协同性，进一步证明其间存在正的协同性。

在MNV中，RdRp与VPg的相互作用促进了RdRp的多聚化和大纤维样结构的形成，这种反应可以通过透射电镜观察到[24]。通过对MNV RdRp晶体结构的分析，以及一个截短的VPg（由前73个氨基酸组成）表明，RdRp的两个氨基酸残基Asp331和Leu354，可能参与了RdRp和VPg之间的相互作用。当将Asp331改为Ala，将Leu354改为Asp时，得到的RdRp变异体在没有VPg的情况下仍然能够形成六聚体，但在VPg存在的情况下不再形成更高级的蛋白结构。此外，这些变异体与全长VPg的结合亲和力明显降低，证实Asp331和Leu354是RdRp与VPg相互作用的关键。据推测，RdRp多聚体和管状原纤维的形成可能导致更大簇内的复制组分更好的协调，从而提高复制效率。

杯状病毒的VPg蛋白连接到基因组或亚基因组的5'末端作为蛋白质引物，在RNA合成起始阶段，提供游离羟基，对病毒RNA的复制起着至关重要的作用[25-27]。从FCV和其他疱疹病毒颗粒中纯化的基因组RNA经蛋白酶K消化后不具有感染性，说明VPg帽的缺失使病毒丧失了感染性[28]。在RHDV聚合酶鉴定出了一个在杯状病毒中高度保守的Tyr残基，它是VPg尿苷酰化位关键位点[29]，也是核苷酸修饰的主要位点，VPg的N端区域对核苷酸修饰具有重要意义，其中VPg与RdRp的相互作用主要依赖于VPg构型[30]。RdRp与VPg相互作用的氨基酸残基保守性不高。目前还没有关于杯状病毒RdRp-VPg复合物结构的信息，但是已经发现MNV和FCV VPg的结构具有独特的二级结构，具有螺旋-环-螺旋结构的[31]。

RdRp的寡聚化在感染细胞中对RNA病毒的复制具有重要意义[32]。研究发现NoV RdRp的活性形式为具有协同活性的同型二聚体[33]。关于RdRps的高阶复合物（它们的低聚物或多聚物复合物）的结构信息还很不完整。最近有报道称，RHDV和RCV RdRps的表达可诱导高尔基体膜的重新分布，但不诱导内质网膜的重新分布，可能通过与膜相关的宿主蛋白与亚细胞囊泡相关[34]。最近，发现RHDV RdRp的疏水基序对亚细胞定位很重要[35]。此外，研究发现, 诺如病毒和MNV衣壳蛋白能增强RdRp活性，并与RdRps发生共免疫沉淀, VP1蛋白与RdRp相互作用的区域已经得到鉴定。RdRp与一系列截短的VP1蛋白的共表达表明，VP1的壳结构域，可以增强聚合酶活性，表明VP1在NoV复制中具有调节作用。利用MNV复制子证实了这一结论：即用VP1表达缺陷的复制子转染细胞后其复制能力受损，但当VP1表达通过反补恢复后，病毒复制能力得到恢复。推测可能是当VP1开始聚合并组装成新的衣壳时，这种正反馈（RNA合成越多，VP1被翻译的越多）就会变慢，从而阻止了它与RdRp的相互作用，并停止了对RNA合成的刺激[36]。

3.2 与细胞蛋白的相互作用 病毒在细胞内复制，要劫持多种细胞中的蛋白质组装其复制复合物，我们最近的研究结果表明RHDV的RdRp可以与核仁素直接相互作用，并以其为中间分子招募HNRNPK、RPL11、RPS5、CSNK2A1和RPL11等细胞蛋白一起组装成复制复合体。沉默或敲除细胞中的核仁素，病毒RNA的复制能力都会受到严重影响。

Urakova等[37]（2017）证明RHDV RNA聚合酶（RdRp）与独特但尚未定性的亚细胞结构相关，并且能够诱导高尔基膜的重新分布。他们发现了一个部分隐藏的疏水基序，它决定了重组RHDV RdRp在转染细胞中的亚细胞定位。这个新的基序位于保守的F3和核心RdRp域的A motif之间的F同形位。其报告表明，核心聚合酶域在其既定的RNA复制活动之外，还具有额外的功能。

3.3 与病毒RNA的相互作用 以RNA为模板的基因组复制在RNA病毒进化中至关重要，其中蛋白质和RNA之间的相互作用在RNA合成的起始阶段起着关键作用[50]。NoV的复制需要其RNA基因组内各种高度有序的顺式作用元件。更重要的是，二级结构的破坏导致病毒复制功能的丧失。许多研究表明，病毒RNA的3'末端含有3个稳定的茎环结构，在病毒复制过程中发挥关键作用。这些颈环结构是RdRp与病毒RNA相结合的区域。有报道表明，RdRp中高度保守的氨基酸残基参与RNA结合（MNV中的Arg396），它们对病毒RNA的合成和病毒复制至关重要[38]。

Han等[38]在MNV RdRp中鉴定出了与基因组RNA相互作用的几个关键氨基酸：Lys169、Lys183和184、Arg185、Lys210、Arg395、396和Lys422。这些带正电的氨基酸残基位于酶活性位点附近，并在杯状病毒科中具有保守性。通过定点突变分析，发现其中带正电荷的氨基酸被非极性的Ala取代后，RdRp与RNA的相互作用效率非常低，病毒复制效率受到严重影响，甚至无法存活。

4 RdRp的功能

4.1 末端转移酶活性 末端转移酶活性是指以模板独立的方式向3'端添加核苷酸的能力。与脊髓灰质炎病毒和HCV RdRps相似，人类诺如病毒RdRps也具有末端转移酶活性[39]。这种活性被认为是细胞外切酶破坏的3'端修复系统，在某些情况下，它通过添加非模板核苷酸促进RNA合成的起始[40]。例如，脊髓灰质炎病毒3D聚合酶的末端腺苷转移酶活性可恢复缺乏poly（A）尾的脊髓灰质炎病毒RNA基因组的感染性。杯状病毒RdRps的末端转移酶活性不仅产生一个保护性的poly（A）尾，还可能产生一个poly（C）尾，其中poly（A）尾被认为在基因组和亚基因组RNA合成的起始阶段起着关键作用。

4.2 启动RNA的合成 在杯状病毒复制中，基因组RNA和反基因组RNA的RNA合成起始阶段不同（图4A、4B、4D）。前者可能以引物独立的方式发生[41]，后者通常被认为依赖于核苷酸化的VPg引物。人诺如病毒的VPg由133个氨基酸组成，比小核糖核酸病毒中同源蛋白的22个氨基酸大很多。然而，更大的体积并不能阻止诺如病毒VPg作为蛋白质引物。Rohayem等[41]在一系列体外实验中证实，诺瓦克病毒的RdRp能够在缺乏poly（U）情况下，以VPg为引物启动亚基因组RNA的合成。但是反义亚基因组RNA的复制，可以不需要蛋白质作引物。有趣的是，在新产生的诺如病毒反义亚基因组RNA的3'端却检测到了poly（C）的延伸，推测这可能是诺如病毒RdRp末端转移酶活性的结果（图4C）。基于这些发现，有人认为亚基因组RNA的合成可能是起始于反义亚基因组末端的poly（C）序列[42]。然而，也有证据表明，杯状病毒的基因组和亚基因组RNA的合成也依赖于VPg引物，因为从MNV感染细胞中分离出的感染性RNA与VPg相关[43]。这些研究证明诺如病毒RdRp可以独立地启动反义基因组RNA以非引物依赖的方式合成。此外，没有poly（A）序列的3'端区域与原始序列RNA一样可以有效地进行复制，表明poly（A）序列对于负链RNA合成的起始并不是必需的[44]。沙坡病毒亚基因组多聚腺苷酸化RNA和反义亚基因组RNA的合成起始也不同，亚基因组RNA的合成的起始是不需要引物的，而反义亚基因组RNA的合成则是严格依赖于引物的，只有在反应中加入oligo（U）引物时才会发生[45]。

图4 在杯状病毒复制过程中RNA合成的起始模式[19]Fig.4 Initiation modes for RNA synthesis during calicivirus replication

4.3 介导VPg的核苷酸化 与成熟复制酶相比，人诺如病毒的聚合酶前体蛋白能更有效地催化VPg核苷酸化[46]。虽然前体蛋白的核苷酸修饰不需要poly（A）模板，但是成熟的RdRp需要这样的模板[47]。人诺沃病毒复制酶前体蛋白同时具有蛋白酶和聚合酶活性，能够启动RNA合成，并能延长新生RNA[48]。FCV RdRp前体蛋白可能也是一种活性聚合酶，因为被感染的细胞含有更多的未裂解前体蛋白酶[49]。研究证实，FCV前体蛋白酶N末端164个氨基酸的缺失可导致聚合酶活性降低3倍，如果再继续缺失下一个氨基酸，酶的活性将降低90倍[50]。

在FCV复制过程中，可以检测到VPg与聚合酶前体蛋白的直接相互作用[51]。这些结果支持了蛋白质启动复制的观点，而且这一观点在对RHDV复制的研究中也得到了进一步的验证。RHDV的RdRp也可将核苷酸转移到VPg[52]。此外，RHDV RdRp前体（p72）对VPg尿苷化的催化作用比成熟酶更活跃[53]。对FCVVPg的突变分析进一步证实FCV采用了蛋白质启动复制的策略：即以Ala替代Tyr24，可以使FCV丧失感染性[54]，因此Tyr24被认为是FCV VPg尿苷化的关键位点。相应的位点在RHDV中，是VPg中的Tyr21。RdRps的底物特异性各不相同。例如，人诺沃克病毒RdRps仅核苷酸化人诺沃克病毒VPg，而MNV的RdRp有效地核苷酸化人和鼠诺沃克病毒的VPg[55]。对于MNV RdRp，这种反应可以通过体外转录的正链和负链亚基因组RNA来增强。在所有被测试的RNA中，亚基因组负链RNA的ORF3区域最有效地刺激了核苷酸化，表明ORF3区域包含一个顺式作用元件来刺激反应。

RdRps的底物特异性各不相同。例如，人诺沃克病毒RdRps仅核苷酸化人诺沃克病毒vpg，而MNV的RdRp有效地核苷酸化人和鼠诺沃克病毒的VPg[55]。对于MNV RdRp，这种反应可以通过体外转录的正链和负链亚基因组RNA来增强。在所有被检测的RNA中，亚基因组负链RNA的ORF3区域最有效地刺激VPg的核苷酸化，提示ORF3区域中可能含有一个顺式作用元件，能刺激复制酶的核苷酸化反应[56]。

5 结语

RdRp是杯状病毒中最为关键的一种蛋白酶，揭示其结构与功能对于了解病毒复制的分子机理，甚至对阐明病毒的致病机制等都具有极为重要的生物学意义。目前，杯状病毒中几种代表性病毒的复制酶结构都已经得到了解析，其功能也在不断被揭示。但是，仍然有很多未解之谜等待我们去破解。关于杯状病毒RdRps是如何启动、延长和终止RNA合成的，它们又是如何帮助病毒建立病毒复制工厂的，它的复制效率与病毒的变异速率和进化方向存在何种关系，以及它是如何帮助病毒逃脱宿主先天免疫反应等问题我们都还知之甚少。