猫传染性腹膜炎诊断研究进展

刘一楠，陈奕熹，汪 刚，毛军福，彭贵青

（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）

1 猫冠状病毒概述

猫冠状病毒（Feline coronavirus, FCoV）是家猫和野猫体内普遍存在的病原体，分为通常只会引起猫轻微腹泻的肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirus, FECV）[1]和致死性的猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus, FIPV）[2]。

FCoV属于冠状病毒科，与犬冠状病毒（Canine coronavirus, CCoV）以及猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TEGV）同属于冠状病毒亚科α冠状病毒属，是有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组约30 kb，有11个开放阅读框（open reading frame, ORF），分别含有四种结构蛋白：刺突蛋白（spike protein, S）、包膜蛋白（envelope protein, E）、膜蛋白（membrane protein,M）和核衣壳蛋白（nucleoprotein, N），以及七种非结构蛋白：辅助蛋白3a、3b、3c、7a和7b，复制酶1a和1ab[3-4]。FCoV有Ⅰ、Ⅱ型两种血清型，根据其致病性可分为FECV和FIPV，其中Ⅰ型FCoV难以在体外培养，Ⅱ型FCoV较易于在细胞培养物中生长。

Ⅰ型FIPV是患病猫中最常见的血清型[5]，但就目前分离到的少数毒株而言，大部分为Ⅱ型。Ⅰ型FIPV的分离和培养困难给该疾病的研究带来了阻碍。尽管对猫传染性腹膜炎发病机制、传播规律和防治进行了数十年的研究，但是FIP仍然是目前最常见的致命性的猫科疾病之一。快速而精准的诊断对本病的预防和治疗具有重要科学意义。

本文罗列了目前常见的几种诊断方法，以期为今后的研究以及临床诊断提供思路。

2 FIP的诊断

猫传染性腹膜炎（feline infectious peritonitis,FIP）最常发生于两岁以下的幼猫[6]。临床症状为食欲不振，嗜睡，体重减轻，发热，眼葡萄膜炎和神经症状等[7]。FIP分为渗出型和非渗出型两种，由于渗出型FIP可以检测的指标相对较多，有助于诊断[8]。但是FIP所具有的症状并非是该疾病的特异性症状，不能仅根据病史以及临床症状确诊，需将这些参数以及实验室检查结果相结合进一步做出诊断。

2.1 临床诊断方法

2.1.1 临床症状检查 渗出型FIP，又称湿性腹膜炎，患病猫腹部膨大，触诊有明显的水样波动；腹水呈粘性，稻草色，透明至中度浑浊[9]。大部分（69%）猫腹腔积液会伴有胸腔炎性渗出[10]；嗜睡，厌食，呼吸困难，黄疸，眼葡萄膜炎，少数出现神经症状。非渗出型FIP：又称为干性腹膜炎，表现为胸腹腔无渗出液，干性腹膜炎的临床症状无特异性[6]，一般包括体温升高、体重减轻、反应迟钝、食欲降低等，部分患病猫出现黄疸、眼内有损伤等，诊断较为复杂。FIP引起的临床症状没有特异性，手术后继发或器官损伤等均可引起胸腹水的产生，而嗜睡，呼吸困难，体温升高，体重减轻等症状也多发于其他疾病，如猫呼吸系统疾病。因此只根据FIP的临床症状难以确诊。

2.1.2 血常规检查与生化检测 猫感染FIP后常见淋巴细胞减少、轻度至中度再生性贫血和由高球蛋白引起的高蛋白血症[11]。当患猫出现高蛋白血症且血液中血清淀粉样蛋白数值升高，白细胞数上升时，提示体内有明显炎症。但是引起炎症的原因和种类较多，仅根据血常规和生化检测也难以诊断猫是否患有传染性腹膜炎。以下是研究总结的数值可以进行辅助诊断。

有研究发现白蛋白与球蛋白的比值（Albumin:Globulin, A:G）可用于辅助诊断FIP，即当这个比值<0.4时患FIP的可能性较大，而>0.8时患FIP的可能性较小[12]。另一个研究团队在一群健康的猫群中检测发现A:G>0.6，他们提出当这一数值>0.6时可排除患有FIP，但这一数值<0.6却无法说明患有FIP[13]。因此，笔者认为A:G的比值越低提示患有FIP可能性越大。猫较少发生严重性贫血，在没有肝酶活性升高或严重贫血的情况下，高胆红素血症的存在可增强猫患有FIP的可能性[14]。

APP称为急性期蛋白，主要由炎症引起巨噬细胞或者单核细胞释放的一类细胞因子。α1-酸性糖蛋白（acid glycoprotein, AGP）是APP的一种，对其含量的测定有助于FIP的诊断，因为在FIP病例中常出现AGP水平升高（>1.5 mg/mL）的现象，因此AGP数值的升高可作为疑患FIP的指标[15]。

血常规和生化检测是动物医院常用的检测方法。上述所提到的检测指标适用于大部分感染FIPV的猫，指标异常与临床症状相结合对FIP的诊断起指导的作用，但是确诊则需要多方面的考量。

2.1.3 影像学检查 对患猫X光检查可见腹部膨大，胸腹腔影像密度增高并呈大面积分布。超声检查患猫在膀胱前方与大肠周围可见大量的无回声区，伴随肝肾指标异常[16]。可通过X光和超声等影像学检查得知患猫胸腹腔是否有积液，同时能够检测肾脏和肝脏是否存在异常，特别是在猫患干性腹膜炎时，若无其他明显症状，可优先使用超声检测肝脏、肾脏来帮助进行FIP的诊断。

2.1.4 Rivalta实验 对湿性腹膜炎而言，检测腹水的成分能有助于疾病的诊断，腹水的测试比血液更有价值[8]。FIP腹水通常是透明、粘稠、微黄且富含蛋白质的液体，总蛋白浓度>35 g/L（>50%球蛋白）。通过Rivalta的实验阳性结果可证明腹水为渗出液。将腹水滴加到8 mLddH2O与一滴98%乙酸的混合液中，腹水若在混合液中保持浑浊液滴状沉入底部则为阳性，若腹水形状消失并与混合液融合则提示为阴性。虽然阳性结果无法直接诊断为FIP，但仍可作为一种有效的辅助诊断方法[17]。

2.1.5 脑脊液检测 非渗出型的FIP患猫更容易出现神经症状[6]，其脑脊液可以检测到FIPV[18]，是诊断神经型FIP最有效的方法。但脑脊液会因蛋白质和炎症细胞增多而变得粘稠[19]，使样品的获得存在一定难度，且操作不当易形成脑疝，所以在进行脑脊液采样的时候，要操作规范。对伴有神经症状的猫进行脑脊液分析时，可见蛋白质浓度和白细胞（主要是嗜中性细胞和单核细胞）数量上升[19-20]。有临床流行病学研究发现：当脑脊液抗体效价大于1∶640时可以确认为FIP，但是该结果的价值有限，因为该研究未设立阴性对照[21]。一份研究报告通过健康猫与患有FIP的猫做RT-PCR检测其脑脊液，发现只有患有FIP（部分出现神经系统症状）的猫的脑脊液中能检测到FIPV，而对照猫则无，因此运用RT-PCR的方法检测脑脊液具有100%的特异性[22]。

总之，脑脊液的检测对于确诊有很大的帮助，其中运用RT-PCR特异性可以达到100%，脑脊液中检测到抗体也可以作为很好的确诊依据。

2.1.6 眼部检查 据报道，约有29%确诊FIP猫的眼球出现以B淋巴细胞和浆细胞等炎性细胞浸润为主的化脓性肉芽肿、葡萄膜炎和脉络膜视网膜炎[10,23]。这些通常继发于眼部结构的炎症和血-眼屏障的破坏，由于眼中存在感染FIPV的巨噬细胞，因此利用免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）技术可以在房水中的巨噬细胞中检测到FIPV抗原[24]。但房水穿刺术主要用于细胞学和临床病理学检测，对淋巴瘤的诊断更有意义[25-26]；对于在未感染FIPV的猫中葡萄膜炎诊断也很常见[27]，因此，仅靠眼球检测不能作为确诊依据。

2.2 实验室检测

2.2.1 RT-PCR 患FIP的猫比患FEC的猫更容易向外界排毒[28]。利用RT-PCR的方法，可检测猫粪便、血液、渗出液和各种组织中的病毒核酸，其中腹腔积液和脑脊液样品中FCoV的检测可以帮助FIP的诊断。研究发现，用RT-PCR的方法检测肠系膜、肠淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏、大网膜等组织样品，除淋巴结外，大多组织的敏感性都很高[29-30]。与血清相比，使用RT-PCR检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）的敏感性更高[31]。

2012年的一项研究中，通过对FECV和FIPV氨基酸序列对比，发现在S蛋白的两个氨基酸（M1058L和S1060A）位点出现差异，并证实利用这两个氨基酸的差异可以在超过95%的病例中将FIPV与FECV区分开来[32]。类似的，2013年有研究发现，FIPV和FECV的S蛋白在弗林蛋白酶切割处有差异[33]。这些为FIP的鉴别诊断提供了新的思路。

有研究学者想通过S基因来鉴别诊断FIP与FEC，使用FCoV特异性引物对102只猫的组织样品进行逆转录酶定量PCR（RT-qPCR），同时对RT-qPCR阳性样品上的S基因进行测序，结果显示这种方法并不能显著增强检测的灵敏度和特异性[28]。笔者认为通过这种思路来鉴别FECV与FIPV是可行的，但还需要对FIPV的致病机制进行研究，了解FECV转化为FIPV的突变位点。

总之，RT-PCR是实验室常用的检测手段，检出率较高，但是目前大多只能检出FCoV。在RTPCR结果为阳性的同时，结合临床症状及生化指标，通常可以判定猫是否患有FIP。

2.2.2 荧光环介导逆转录等温扩增 （reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）有研究团队探索这种方法来检测FCoV的存在，通过琼脂糖凝胶和羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue,HNB）染色来判定，结合RT-PCR以评估灵敏度和特异性。结果显示，样品总体特异性接近100%，但琼脂糖凝胶和HNB的灵敏度分别为50%和54.5%。因此，RT-LAMP似乎是确认病毒存在的很好方法，但不适合用于对阴性样品的排除[34]。这种方法不需要昂贵的设备和复杂的操作，可减少诊断的时间且特异性强（97%），但是该种方法存在灵敏度低（58%），检测结果有一定误差的缺点[35]。

2.2.3 血清抗体检测 FCoV感染后机体会产生特异性的抗体[36]，实验性感染最早在7～28 d可检测到抗体[37-38]，因此抗体检测可以在疾病的早期进行。但是患有FIP的猫大约有10%没有血清抗体的产生[39]，在这些猫中，可能是炎症导致血液成分（包括抗体）外渗，因此，无法通过抗体测定法来判定[40]。最近一项研究表明，FCoV病毒血症甚至不能说明FIP，因为测试发现FCoV呈阳性的健康猫在测试的6个月内均未出现FIP或临床疾病[41]，所以从腹水中或者脑脊液中检测到FIPV病毒会比血清中检测到病毒更有助于诊断。

FCoV的血清抗体检测方法有酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法、间接免疫荧光抗体检测（immunoinfluscent assay test,IFAT）法和快速免疫迁移试验[42]。这些检测方法都是以抗原（例如：FCoV感染的猫细胞）作为底物，来检测不同稀释倍数的血清。间接免疫荧光是检测FCoV的金标准，当检测结果为阴 性时则提示猫不会排毒，而血清检测结果呈阳性时，则提示猫已被FCoV感染且产生抗体（感染2～3周后）。Ⅰ、Ⅱ型FCoV和猪传染性 胃肠炎病毒都可以利用间接免疫荧光的方法进行检测。值得注意的是，在个别情况下检测结果会受到影响，比如并发感染（FIV与全身性真菌病）、自身免疫疾病、近期免疫接种和使用治疗甲状腺机能亢进的药物（甲巯咪唑、他巴唑、甲硫咪唑）等，因此，应使用未感染的正常细胞作为阴性对照，若结果为阳性且正常、细胞为阴性，则可证明底物与FCoV结合[40]。

2.2.4 抗体检测试剂盒 抗体检测方法灵敏度高、专一性强，是未来最有可能大量应用于市场的检测方法。有研究团队对这些检测方法进行评估，包括IFAT和ELISA。间接免疫荧光抗体测试的灵敏度可达96%，而ELISA在样品量较少时是最佳的选择[42]。目前市场上已有FCoV抗体的检测试剂盒，但是这些试剂盒还无法精确检测FIPV，因此还需要进一步研发针对FIPV检测的试剂盒。

2.2.5 腹水的免疫检测实验 将腹水样品作为底物来检测是否存在FIPV抗体的方法所得结果差异性大，有研究者提出抗体检测和RNA检测相结合可用于湿性腹膜炎的诊断[40,43]。

将腹腔渗出液离心得到的细胞沉淀用福尔马林固定，再用石蜡包埋，通过免疫组化（immunohistochemistry, IHC）的方法来进行检测，尽管处理时间较长，但可以提高FCoV抗原检测的可靠性，且已有报道用脑脊液离心得到的巨噬细胞做免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）可检测到FCoV[44]。

腹水的产生作为湿性腹膜炎重要的临床症状，获得腹水对诊断有很大的帮助，但是FCoV也有可能会存在于没有患FIP的猫渗出液中[35,45]。所以单独的腹水病毒检测并不能作为确诊依据，需要多方面一起考虑。

2.2.6 病理变化 病变组织内FCoV抗原的免疫组织化学染色被认为是用于诊断FIP的另一种金标准[10]，对猫活检常使用两种方法：Tru-cut活检（TCB）和细针穿刺活检（FNAB）。有研究团队实验，将组织样品固定后切片，通过免疫细胞化学（ICC）或免疫荧光（IF）对组织（通常为积液）样品进行染色，利用抗体与FCoV抗原的结合，通过颜色变化（ICC）或产生荧光（IF）来判定结果，但是，用这些方法检测结果显示灵敏度低[46]，作者对此的解释是由于细胞损伤使获得的样品不足[47]。此外，在肠系膜淋巴结样本中发现假阳性免疫细胞化学结果，导致特异性仅为91%。因此，仅由FNA或TCB获得的样品做免疫细胞化学（ICC）无法确诊FIP[46-47]。

通过FIP引起的组织病理变化对巨噬细胞做免疫组化（IHC），敏感性可达97%～100%[48]。IHC还被用于检测异常组织或非家养猫科动物巨噬细胞中的FCoV抗原。例如，在两只由FIP引起的具有非典型皮肤损伤的猫的皮肤中检测到FIPV抗原[48]，在狮子的眼组织中检测到FCoV抗原[49]。

总之，目前最常用、有效的检测方法是RTPCR，结果判定为阳性后结合临床生化血常规检测可以确诊是否感染FCoV，特别是用腹水和脑脊液作为样品所得的阳性结果可以帮助对FIP的诊断。FCoV突变性高，不同毒株之间基因差异大，因此对RT-PCR引物的设计要求高。实验室还可以利用血清学抗体检测的方法，这种方法有着方便快捷、特异性强、灵敏度高的优点，相信在未来这种方法能够得到更多的应用。

3 诊断路线图

总结之前的诊断思路，作出以下的诊断路线图供兽医师参考。

图1 诊断路线参考图Fig.1 Diagnostic route reference

4 展望

目前我们无法基于一项诊断方法来确诊FIP，需要综合疑似患有FIP猫的病史、临床特诊和临床病理指标来判断。根据实际情况，使用多种测试方法，对每只病猫进行常规血液学，血清生化检查以及渗出液分析，尤其是对病毒的检测。对于具有神经系统症状的猫，进行脑脊液分析可以起到帮助确诊的作用。

近年来，大部分研究者都把目光聚焦在S蛋白上。S蛋白可以诱导膜融合，对病毒的入侵起到重要作用[50-51]。研究发现，FIPV和FECV S蛋白的部分氨基酸会出现稳定差异[32]，这些差异可以通过测序进行比较，进一步确定是FECV感染还是FIPV感染，为诊断FIP提供了新的思路。笔者认为具有特异性的突变位点的发现将对FIP的诊断提供广泛的应用价值。

FECV的RNA广泛存在于全身各处，但是患FECV和患FIPV的猫所带的病毒量有明显差异[28]，因此定量分析病毒含量可以为鉴别诊断提供帮助。

最近有研究者在猫冠状病毒非结构蛋白nsp3上发现有两种肽对区分FECV和FIPV有潜在价值[52]。也有研究表明，3c基因的截短能够引起FECV向FIPV转变，是FECV-FIPV转换的决定性因素[1,4,53-54]。

综上，本文阐述了目前针对FIP的临床诊断方法，以及实验室常用的检测手段。讨论了FIPV与FECV的区别与转化的观点，这些为之后寻找FIPV与FECV之间的差异提供思路；本文还讨论了FECV与FIPV的差异包括患猫体内的病毒量的不同等。研究显示S蛋白对FECV与FIPV毒力的强弱起到关键作用[55]，所以S蛋白在区分这两种病毒上具有潜在研究价值。随着对猫冠状病毒研究的不断深入，我们相信，在不久的将来，FIP的鉴别诊断、预防及治疗能够更加高效、特异。