沉默信息调节蛋白3在日光性角化病和皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义

郭美亮，刘婉雯，孟琴琴，袁定芬，邓辉

（上海交通大学附属第六人民医院，上海 200233）

日光性角化病（Actinic keratosis，AK）和皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）都是以角质形成细胞异常增殖为特征的皮肤疾病。AK是由紫外线（UV）辐射引起的表皮角质形成细胞发育不良的病变，有发展为cSCC的能力，被认为是cSCC最常见的癌前病变[1-2]。cSCC是最常见的皮肤肿瘤之一，近年来其发病率逐年累增，在皮肤肿瘤中仅次于基底细胞癌[3]。近年来，沉默信息调节蛋白（SIRT）与肿瘤的关系成为研究热点。在癌症中，SIRT3有抗肿瘤和促肿瘤的双重效应。在乳腺癌、肝癌、淋巴瘤中，SIRT3被认为是一种肿瘤抑制蛋白并且与患者生存率的提高有关[4-6]。而在食管癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤疾病中，SIRT3的高表达被认为是肿瘤细胞生长的促进因素和预后的负相关因素[7-10]。然而，SIRT3在皮肤非黑素瘤皮肤癌中的作用尚未有明确报道。本研究拟通过检测SIRT3在正常皮肤（NS）、AK和cSCC的表达，从而初步探讨SIRT3在AK、cSCC发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2017年6月—2020年3月于我院就诊患者中，根据临床表现和组织病理，确诊为AK的30例和cSCC的28例石蜡组织标本。30例皮肤正常对照组来自于良性肿物手术切除附带的正常皮肤。

1.2 主要试剂 SIRT3抗体购自美国Affinity公司（AF5135），抗体使用浓度为 1∶200。免疫组化试剂盒（SA1022）和DAB显色试剂盒（AR1022）购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 免疫组化 将组织蜡块4 μm切片，置于防脱载玻片上。后续操作步骤严格按照试剂盒要求进行，主要步骤包括脱蜡、梯度水化、抗原修复、灭活过氧化氢酶、破膜、胎牛血清封闭、滴加一抗、滴加生物素标记二抗、滴加SABC复合物、DAB显色、苏木素复染、梯度脱水、封片。

1.4 结果判定 高倍镜下随机选取3个视野，利用Image Pro Plus软件综合染色阳性细胞率和染色强度评分进行半定量分析。阳性细胞率评分标准：阳性细胞率5%以下为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，75%以上为4分。染色强度评分标准：无染色为0分，浅染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。2项结果评分相加，分为4个等级：0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（++），6分以上强阳性（+++）。

1.5 统计学分析 采用SPSS 23.0软件分析统计结果。计量资料采用均数±标准差表示，计数资料比较用χ2检验，多组之间的的阳性率比较用方差分析，其中两两比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT3在NS、AK和cSCC组织免疫组化染色情况 SIRT3主要表达于表皮细胞的胞质，在NS组和AK组中，SIRT3主要呈弱阳性或中度阳性表达，见图1、2，在cSCC组中，SIRT3主要呈中度阳性或强阳性表达，见图3。

图1 SIRT3在NS组织中表达（免疫组化染色 a×100，b×200，c×400）

图2 SIRT3在AK组织中表达（免疫组化染色 a×100，b×200，c×400）

图3 SIRT3在cSCC组织中表达（免疫组化染色 a×100，b×200，c×400）

2.2 NS、AK和cSCC组织中SIRT3表达差异 SIRT3在NS、AK和cSCC组织中的阳性细胞率呈递增趋势，3组内的差异有统计学意义，见表1。各组间阳性细胞率的比较结果显示cSCC组织的SIRT3阳性细胞率显著高于NS和AK组织，差异有统计学意义，而NS和AK组织之间的阳性细胞率差异无统计学意义，见表2。SIRT3在NS、AK和cSCC组织中强阳性率呈递增趋势，3组内的差异有统计学意义，见表1。组间强阳性率的比较结果显示cSCC组SIRT3表达强阳性率显著高于NS组，差异有统计学意义，而NS组和AK组、AK组和cSCC组之间的强阳性率差异无统计学意义，见表3。

表1 SIRT3在NS、AK和cSCC组织中的表达

表2 NS、AK和cSCC组织中SIRT3表达阳性细胞率的比较

表3 NS、AK和cSCC组织中SIRT3强阳性率的比较

3 讨论

SIRT是一种从细菌到人类都高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白去乙酰化酶，与酿酒酵母沉默信息调节因子2（Sir2）有同源性[11]。目前，哺乳动物体内已经鉴定出SIRT1-7，其有不同的亚细胞定位和生物学功能。研究发现，SIRT在调节氧化应激，维持基因组稳定性，调节细胞生长和代谢和衰老等生理过程中发挥重要作用。SIRT3主要位于线粒体中，也有研究者认为SIRT3在细胞核和细胞质内也有表达[11-13]。SIRT3可以使氧化应激所必需的，包括抗氧化酶和参与线粒体功能和三磷酸甘油酸（ATP）合成的多种酶去乙酰和活化，因此SIRT3对线粒体蛋白的翻译后修饰在维持能量代谢、活性氧（ROS）水平和其他线粒体功能中起着重要作用[14]。SIRT3作为一种新的肿瘤标志物，与肿瘤细胞增殖密切相关，但SIRT3在肿瘤进程中的作用有双面性。一方面，作为肿瘤抑制因子，SIRT3在乳腺癌中通过抑制低氧诱导因子-1α（HIF-1α）从而抑制糖酵解和合成代谢，从而减少癌细胞增殖[15]。此外，SIRT3也能够通过靶向B细胞淋巴瘤（Bcl-2）诱导细胞凋亡，而SIRT3的缺失则会通过ROS依赖途径促进增殖[6，16]。另一方面，作为肿瘤基因的SIRT3被认为能维持ROS从而防止细胞凋亡和促进细胞增殖[17]。另外SIRT3也能通过使脱氧核糖核酸（DNA）修复相关蛋白Ku70去乙酰化，从而促进Ku70与促凋亡蛋白Bax，减少细胞凋亡[18]。肿瘤抑制蛋白p53也与SIRT3的促肿瘤过程相互关联。细胞定位实验发现SIRT3和p53在线粒体中存在共定位，细胞功能实验则发现SIRT3能够抑制p53的生长抑制活性，表明p53是SIRT3调节细胞增殖的重要下游蛋白[18-19]。

cSCC的进展过程一般认为始于紫外线（UV）照射后诱发的AK，在此基础上进一步发展为原位SCC、浸润性SCC，最后进展为转移性SCC[20]。约有58%的cSCC带有UV引起的特征性突变，因此UV在cSCC发病过程中的作用可能与通过诱导p53失活，引起细胞基因组维持能力受损有关[21]。另外，一项研究显示UV照射会引起线粒体SIRT3水平和活性氧的失调[22]，而补充烟酸能够逆转SIRT3的上调和光损伤，提示SIRT3在UV刺激后的水平变化可能是一种应激性的改变[23]。

本研究发现SIRT3在cSCC患者的肿瘤组织中表达高于正常人，鉴于p53在AK和cSCC病程中的作用和SIRT3对p53的抑制功能，笔者推测包括UV在内的各种因素诱发的SIRT3水平变化可能通过p53参与了AK和cSCC的进展过程。其他研究发现口腔SCC细胞系虽然SIRT3表达升高，但其去乙酰化活性却降低了[24]。因此，SIRT3的去乙酰化活性在AK和cSCC中的作用仍需要更多的证据支持。