重楼不同皂苷成分对痤疮相关致病菌的体外抑菌作用研究

汪玉梅，范倩，刘柏汝，胡金珊，张翠仙

（广州中医药大学，广东 广州 510006）

痤疮是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，以丘疹、粉刺、脓疱、囊肿等为主要临床特征。该病虽不会危及生命，但作为面部损容性疾病可严重影响患者的身心健康。目前认为痤疮多因雄性激素分泌增多，使得皮脂腺分泌亢进及皮脂腺导管角化，堵塞毛囊，从而引发毛囊内革兰阳性厌氧菌痤疮丙酸杆菌大量繁殖，以及局部皮肤合并感染革兰阳性需氧菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌等病原体所致[1-2]。病原体产生的溶脂酶、蛋白分解酶及透明质酸酶等分泌物可对皮肤产生刺激作用，引发红丘疹、脓疱、囊肿等临床表现。临床以抑制皮脂腺分泌和抗感染治疗为主，但抗生素的耐药性日趋严重[3]。

痤疮中医属“肺风粉刺”范畴。其中，中重度痤疮临证表现多是脓疱、囊肿、触之疼痛。中医认为其多由饮食不节，脾胃积热，生湿生痰，聚而成形，凝滞肌肤，化生脓肿，故治以清热利湿解毒、化痰散结为主[4]。通过多次临床观察，笔者发现对于中重度痤疮患者，在辨证用药的基础上，加上有清热解毒散结、消肿止痛的中药重楼后，其临床疗效及取效时间却大有改观。药典记载重楼常用于治疗疔疮痈肿[5]。结合课题组前期实验研究及文献研究，发现重楼提取物、其内生菌及代谢产物对多种致病菌都显示出一定的抑菌活性[6-9]。但关于重楼对于痤疮主要病原菌抑菌作用报道较少。基于此，为进一步探索重楼临床治疗痤疮的作用机制，本研究通过体外抑菌实验考察4种重楼不同皂苷成分（重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ）对3种痤疮相关致病菌（痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌）的抑菌作用，旨在为痤疮的临床治疗提供更多、更有效的用药选择，从而提高临床疗效，改善患者的身心健康。

1 材料与方法

1.1 材料 标准品：重楼皂苷Ⅰ（批号：C-036-151122），重楼皂苷Ⅱ（批号：C-037-160623），重楼皂苷Ⅵ（批号：C-038-160126），重楼皂苷Ⅶ（批号：039-160623），购于成都瑞思生物科技有限公司。罗红霉素、克林霉素标准品（Sigma，USA），购于广州东巨实验仪器有限公司。

菌株：痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，菌号GIM1.243）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，菌号 ATCC100178）；表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，菌号 ATCC49134）均购自广东省微生物研究所。

培养基：脑心浸液培养基（BHI培养基）、水解酪蛋白培养基培养基（MH培养基）均由广东微生物研究所提供。

1.2 仪器与设备 SW-CJ-1F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；HPG-280HX人工气候培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；NanoDrop One超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Infinite M200 Pro NanoQuant酶标仪（瑞士TECAN公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备 取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ用二甲基亚砜（DMSO）配制成1 g/L单标溶液，取各单标溶液适量，配制1 g/L的混标对照溶液。取罗红霉素和盐酸克林霉素用DMSO配制成1 g/L的阳性对照溶液。

1.3.2 菌种培养 取出保存的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌菌株，采用平板划线法接种到相应培养基上（平板）。将痤疮丙酸杆菌用BHI培养基在培养温度为37℃的厌氧培养箱静置培养48 h，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌用LB培养基37℃培养箱中培养24 h来进行菌种复苏。然后从长有菌落的平板上挑取单菌落，置于37℃恒温培养箱中以180 r/min振荡培养12～14 h。依次传代下去，得到适合做实验的第3～5代菌。

1.3.3 抑菌活性测定 在加入96孔板前将菌液稀释至含菌数为1×105CFU/mL。最小抑菌浓度（MIC）通过液体微量稀释法测定。96孔板放入37℃恒温培养箱20～24 h后，观察结果，肉眼观察不明显时可测试其OD验证，得到MIC值。浊度用酶标仪。具体参照美国临床实验室标准化委员会。

1.3.4 分组 以罗红霉素和盐酸克林霉素为阳性对照组；以只含液体培养基和相对应菌液为阴性对照组，同时仅含培养基的作为空白对照组。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ及阳性对照药品的96孔板初始浓度均为1 g/L，后按倍比稀释，同一浓度设置3次平行试验。将96孔板放入37℃恒温培养箱20～24 h后，观察结果，肉眼观察不明显时可测试其OD验证，得到MIC值。

2 结果

重楼不同皂苷成分体外对3种痤疮相关致病菌的抑菌实验结果，见表1。依据浊度测定结果，重楼不同皂苷单体对痤疮相关致病菌均表现出一定的抑制作用。其中，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ对金黄色葡萄球菌的 MIC 依次为 15.6、15.6、500、15.6 μg/mL，对表皮葡萄球菌的MIC依次为15.6、15.6、500、31.2 μg/mL，说明重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌作用较为明显，而重楼皂苷Ⅵ对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌作用不明显。另外，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ对痤疮丙酸杆菌菌株的MIC均为125 μg/mL，说明抑菌作用较弱。

表1 重楼不同皂苷成分体外对3种痤疮相关致病菌的MIC比较 μg/mL

3 讨论

重楼又名蚤休，始载于《神农本草经》，为百合科多年生草本植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎[5]，民间多用于治疗无名肿毒和毒蛇咬伤，临床广泛用于治疗咽喉肿痛、惊风抽搐、跌打伤痛、出血以及肿瘤等疾病。药理研究显示该药有良好的抗肿瘤、抗菌、止血[10-12]等作用，对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌及部分真菌有一定抑制作用，并且产生抗药性的几率远低于抗生素类药物。Qin等[11]从滇重楼茎叶中分离得25种甾体皂苷，其中chonglouosides SL-1-SL-6、重楼皂苷A、重楼皂苷V和progenin Ⅱ这4个化合物有较强的抗菌活性，其抑制痤疮丙酸杆菌的 MIC 分别是 3.9、16.5、17.2、7.8 μg/mL。

由上述结果可看出，从对不同菌株的MIC值来看，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ对厌氧菌痤疮丙酸杆菌的抑制效果与其他菌株相差较大，抑菌作用较弱；而对需氧菌表皮葡萄球菌及金黄色葡萄球菌抑制效果大致相同，较为理想；从化合物之间的抑菌活性来看，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ总体上对后两种致病菌的抑制程度都较为显著，并且其抑菌作用都强于重楼皂苷Ⅵ；从其结构上来看，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ均属薯蓣类糖苷，其对需氧菌的MIC值偏小。而重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ属偏诺类糖苷，其抑菌效果总体上较弱，但重楼皂苷Ⅶ的抗菌活性远大于重楼皂苷Ⅵ。观察其结构发现，二者虽然母核相同但所连接的糖链不同，重楼皂苷Ⅶ的糖链由4个糖组成，而Ⅵ的糖链由2个糖组成。故可以推测重楼皂苷的苷元不同、所连的糖链长度不同，糖基种类不同均可能影响其抑菌活性的表达。

由本次实验结果也发现，重楼不同皂苷单体的MIC值均高于阳性对照组抗生素的MIC值。因此，在后续实验中，笔者将对有效提取部位的化学成分展开进一步的研究，分析其有效成分，为后续治疗痤疮相关药物的开发打下基础。