靶向肠道M细胞的PEDV COE基因的蛋白表达与纯化

崔玉莹，戴继鸿，李村院，郭 涛，李晓悦，姚 瑞，胡瑞瑞，刘开平，米桃桃，倪 伟*，胡圣伟* (.石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 832000；2.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种以腹泻、脱水和呕吐为主要临床特征的高度传染性的肠道致死性疾病[1]。PEDV是一种影响所有年龄段猪的肠道病原体，在哺乳仔猪中通常是致命的，发病率相当高，病死率达80%～100%。在成年猪中，发病率很高，但病死率低[2]。20世纪70年代在英国首次报道该病，随后传播到欧洲和亚洲的其他地区[3-4]。2010年，我国在血清学呈阳性的众多不同地区的猪场暴发了PED[5]，发现了高发病率的新变异毒株[6]，同时美国、加拿大等一些国家的猪场也未能幸免，给全世界的养猪业带来了重大经济损失。

PEDV基因组为单链RNA，全长约为28 kb[7]，编码纤突糖蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M) 4种结构蛋白以及其他3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3编码[8])，其中S蛋白在PEDV感染中起着至关重要的作用，主要表现在N端S1亚基与受体结合和C端S2亚基的膜融合[9]。S蛋白是主要的包膜糖蛋白，在S1亚基上含有的核心中和表位(COE)位于S蛋白的499～638位氨基酸处，可诱导产生抗PEDV的中和抗体[10]，可被用作抗PEDV的潜在候选免疫原[11]。因此，S蛋白被认为是PEDV中和抗体的靶标位点。

微折叠细胞(microfold cell，M细胞)主要位于肠道相关淋巴组织(GALT)中派氏结的滤泡相关上皮(FAE)、鼻咽相关淋巴组织(NALT)的淋巴滤泡和结膜组织的淋巴滤泡中[12-13]。M细胞的主要作用是将肠腔内抗原摄取和胞吞到GALT中，因为它们具有高吞噬和胞吞能力，负责将抗原快速转运到抗原呈递的未成熟树突状细胞中[14-15]。随后，这些树突状细胞经历成熟并激活抗原特异性初始T细胞，这些T细胞使B细胞活化，最终激发可产生IgA的浆细胞[16]，诱导黏膜免疫反应。M细胞表面有很多特异性受体，如C5aR[17]、GP2[18]、α(1,2)-Fucose[19]、Claudin 4[20]等，其配体也已经被发现。将抗原与黏膜免疫细胞的配体进行融合表达后就可以借助受体与配体的结合，从而实现抗原准确地靶向递送。本试验使用的是M细胞表面受体C5aR与其配体Col，将Col基因序列连接至PEDV的核心中心表位COE基因序列上，克隆基因COE和COE-Col，构建PET-32a(+)-COE和PET-32a(+)-COE-Col重组表达载体，转化至表达载体TransB(DE3)使其诱导表达并进行纯化浓缩，为后续制备M细胞靶向的黏膜免疫疫苗提供材料。

1 材料与方法

1.1 菌种、载体和质粒克隆载体菌株DH5α、载体PET-32a(+)、表达载体菌株TransB(DE3)、pET-28a-COE-DH5α质粒均为本实验室保藏。

1.2 主要试剂及仪器胰蛋白胨、琼脂糖、酵母提取物、SDS、丙烯酰胺、NaOH、过硫酸铵、甘氨酸等均由上海生工生物公司提供；质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒、DNA纯化试剂盒等由北京天根生物科技有限公司提供；EcoRⅠ、XhoⅠ、DNA连接酶等酶由TaKaRa公司提供。

BIORAD凝胶成像系统购自BIORAD 公司；PCR 扩增仪、微量核酸蛋白浓度测定仪、微型离心机购自北京东林昌盛生物公司；超净工作台、ZX-3D 电热恒温水槽购自金坛科兴有限公司；JY600C电泳仪购自北京君意东方有限公司。

1.3 方法

1.3.1COE和COE-Col引物的设计 利用生物学软件DNAMAN 7.0对自2010年以后国内PEDV流行株S基因的COE(499～638 aa)氨基酸序列进行同源性比对，选取相对保守的毒株CH/PDS/2015 (GenBank 登录号：KU237224，中国 河南)，根据大肠杆菌系统对密码子的偏好性，优化序列中存在的稀有密码子，设计特异性引物，并在5′末端引入酶切位点EcoRⅠ和起始密码子ATG，3′末端引入酶切位点XhoⅠ，获得了COE-F1和COE-R1没有靶向肽的COE基因引物。COE-R2为包含了Col下游引物，COE-R2中的C端与Col序列结合，再将柔性氨基酸接头序列(GS)插入到COE基因和Col之间[21]。引物序列见表1(用于克隆的限制性内切酶识别位点以下划线显示)，由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应体系(20.0 μL)：2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，模板质粒1.0 μL，上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.5 μL，加ddH2O补足至20.0 μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 40 s，共35个循环；72℃延伸2 min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.2pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col重组表达载体的构建COE和COE-Col基因克隆后使用DNA回收试剂盒进行胶回收并纯化，用EcoRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶对纯化后的目的基因和载体pET-32a(+)质粒进行双酶切，酶切体系见表2，放至37℃水浴锅中酶切1 h。将酶切产物使用1%的琼脂糖凝胶鉴定后切胶回收，并将得到的目的基因与载体连接。COE和pET-32a(+)连接体系：10.00 μL SolutionⅠ(酶溶液)，6.46 μL pET-32a(+)，3.54 μLCOE，总体积为20.00 μL 。COE-Col和pET-32a(+)连接体系：10.00 μL SolutionⅠ，6.72 μL pET-32a(+)，3.28 μLCOE-Col，总体积为20.00 μL。在16℃条件下连接4 h。将连接好的2个重组质粒转化至已制好的感受态细胞DH5α中，涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37℃恒温箱中过夜培养。

1.3.3重组表达载体的验证 在培养完毕后的平板上挑取阳性单克隆菌落至LB液体培养基(Amp+)中，37℃、200 r/min摇至浑浊。(1)菌落PCR：取1 μL摇好的菌液做菌落PCR，反应体系和程序与1.3.1相同，再使用1%琼脂糖凝胶鉴定。(2)双酶切：经菌落PCR鉴定出有条带的扩大培养，小提重组质粒，经EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，体系同1.3.2。(3)将经菌落PCR和双酶切都鉴定正确的重组质粒送至上海生物工程有限公司测序。

1.3.4重组COE和COE-Col蛋白的诱导表达 将测序验证基因序列正确的重组表达质粒pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col转化至大肠杆菌TransB(DE3)感受态细胞后，将其涂布至含Amp抗性的LB固体平板上过夜培养，挑取阳性单菌落，菌液PCR鉴定，将鉴定正确的重组菌株命名为pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)和pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)。

取鉴定正确过夜培养的pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)和pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)菌液，接种于20 mL含Amp 的液体LB培养基，37℃、180 r/min振荡培养至D600 nm=0.6。按比例加入1‰的诱导剂IPTG，使其终浓度达到1 mmol/L，对照样品不加诱导剂，37℃、200 r/min继续振荡培养6 h。

1.3.5重组蛋白可溶性鉴定 将pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)和pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)扩大培养，IPTG诱导完成后，在4℃ 条件下，8 000 r/min离心5 min收集所有菌体，弃上清，加入35 mL裂解缓冲液置于4℃过夜裂解菌体。将过夜裂解的菌液离心管放入液氮中冷冻5 min，再置于37℃水浴锅内反复摇晃使其快速融化，如此反复冻融3次，此时菌液应呈黏稠状。随后使用超声破碎仪对菌液进行超声，程序设置为超声3 s，停2 s，破碎至菌液澄清，超声时离心管始终置于冰水混合物中。取超声破碎后的菌液1 mL，12 000 r/min 离心10 min，分离上清样品(可溶性蛋白)与沉淀中样品(包涵体蛋白)，加入蛋白上样缓冲溶液煮沸处理后，SDS-PAGE 鉴定目的蛋白可溶性表达情况。

1.3.6重组蛋白的亲和纯化 向沉淀中加入25 mL 的8 mol/L尿素溶液，置于摇床上室温过夜溶解，使用0.45 μm滤膜过滤。使用GE公司His标签蛋白纯化预装柱 HisTrapTMFF Crude纯化目标蛋白，基本步骤如下：使用一次性注射器吸取5倍柱床体积的蒸馏水，缓慢推入蛋白纯化预装柱内， 洗去柱内的20%乙醇溶液，推荐流速约为2 mL/min；柱平衡： 5倍柱床体积的结合缓冲液平衡柱，流速约为2 mL/min；上样：吸取过滤后的蛋白溶液5 mL缓慢推入蛋白纯化柱内，流速控制在1 mL/min以内，当推入2 mL蛋白液体后将纯化柱置于冰上静置3～5 min。在此步操作中应注意放缓上样速度，减小因目标蛋白未充分与纯化柱中的镍结合而造成的损失，影响纯化效率。杂蛋白洗脱：10 倍柱床体积的结合缓冲液洗脱杂蛋白，流速约为2 mL/min；目的蛋白洗脱：10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，流速约为1 mL/min，收集前20 mL洗脱液。

1.3.7脱盐与复性 将3 kDa分子截留的透析袋于EDTA-NaHCO3溶液中煮沸10 min，蒸馏水充分清洗后装入蛋白溶液，透析袋夹封口，放入透析液中透析。透析溶液依次为8，6，4，2 mol/L尿素及1×PBS 缓冲液，每次透析6 h。使用后的透析袋经蒸馏水清洗干净后，保存于20%乙醇溶液中。

1.3.8重组蛋白浓缩及质量浓度测定 蛋白溶液经1×PBS缓冲液透析结束后，将蔗糖撒在透析袋外，待透析袋中剩余液体量适宜时，即可收集蛋白溶液，分装至无菌EP管中，置于-80℃保存备用。使用康为世纪BCA蛋白定量试剂盒测定浓缩后的重组COE和COE-Col蛋白相对分子质量浓度。

1.3.9重组蛋白理化性质和结构 使用在线网站工具Expasyprotparam预测重组蛋白的理化性质；使用SOPMA预测其二级结构；使用SWISS-MODEL预测其三级结构。

2 结果

2.1COE和COE-Col基因克隆根据pET-32a(+)载体序列和COE序列引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，设计COE基因引物。在此基础上插入靶向肽序列，通过PCR扩增获得目的基因COE和COE-Col，使用琼脂糖凝胶电泳验证。经鉴定，得到了约为423(COE)和471 bp(COE-Col)明亮的单一条带(图1)，与预期的2个目的基因条带大小相符，表明成功克隆了目的基因。

M.DL1000 DNA Marker； 1.基因COE的PCR扩增产物；D1.基因COE的PCR扩增阴性对照；D2.基因COE-Col的PCR扩增阴性对照；2.基因COE-Col的PCR扩增产物图1 COE和COE-Col基因的PCR扩增

2.2COE、COE-Col和载体pET-32a(+)的酶切使用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对目的基因和载体pET-32a(+)进行双酶切，琼脂糖凝胶结果显示，得到了423 bp的COE片段、471 bp的COE-Col片段和5 900 bp的pET-32a(+)载体片段(图2)。

M.DL2000 DNA Marker；D.未酶切的空载体pET-32a(+)；1～3.pET-32a(+)质粒酶切产物；4～6.基因COE酶切产物；7～9.基因COE-Col酶切产物图2 COE和COE-Col基因及载体pET-32a(+)的酶切产物

2.3 重组表达载体的构建与鉴定回收酶切后的COE、COE-Col基因与pET-32a (+)载体片段，用SolutionⅠ进行连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含氨苄抗性的LB固体平板上筛选菌落，随机选择若干单菌落进行菌落PCR，并通过琼脂糖凝胶鉴定，结果见图3。 其中，pET-32a(+)-COE-DH5α菌落1～3均可扩增出约423 bp的目的片段，pET-32a(+)-COE-Col-DH5α菌落4～6均可扩增出约471 bp的目的片段。选取3和4号菌扩大培养提取质粒进行双酶切，如图4A中3号菌得到了约5 900,423 bp 2条片段，图4B中4号菌得到了约5 900,471 bp 2条片段，即2个重组表达载体中都含有所预期的目的基因片段。经鉴定无误的质粒交由上海生物工程有限公司测序，利用DNAMAN将已知的基因序列与测序结果比对，测序结果显示两者完全一致，证明重组质粒pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col连接正确，成功构建了重组原核表达载体。

M.DL1000 DNA Marker；D1.pET-32a(+)-COE菌液PCR扩增阴性对照；1～3.pET-32a(+)-COE菌液PCR扩增产物；D2.pET-32a(+)-COE-Col菌液PCR扩增阴性对照；4～6.pET-32a(+)-COE-Col菌液PCR扩增产物图3 重组质粒pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col的菌落PCR鉴定

M.DL1000 DNA Marker；D1.未酶切的重组质粒pET-32a(+)-COE；1.重组质粒pET-32a(+)-COE的双酶切；D2.未酶切的重组质粒pET-32a(+)-COE-Col；2.重组质粒pET-32a(+)-COE-Col的双酶切图4 重组质粒pET-32a(+)-COE(A)和pET-32a(+)-COE-Col(B)的双酶切鉴定

2.4 重组COE和COE-Col蛋白的诱导表达和纯化将获得的重组表达菌株扩大培养，经过IPTG诱导并进行超声处理后，离心分离上清与沉淀样品，通过SDS-PAGE鉴定，图5A泳道4的COE沉淀条带和图5B泳道4的COE-Col沉淀条带证明2个重组蛋白都以包涵体形式表达，结果表明pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)能表达出大小约为35 kDa的COE蛋白，pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)能表达出大小约为37 kDa的COE-Col蛋白。利用HisTrapTMFF Crude 亲和层析柱纯化蛋白，SDS PAGE结果显示，成功纯化获得了图5A泳道5的重组COE蛋白和图5B 泳道5的重组COE-Col蛋白的单一条带。将重组COE和COE-Col蛋白纯化、复性及浓缩后通过BCA法测定质量浓度，标准曲线方程：y=1.234 4x+0.112 9，相关系数R2=0.989 0，将在酶标仪上测得的D570 nm值代入标准曲线方程，计算得到重组COE蛋白质量浓度为1.05 g/L，COE-Col蛋白质量浓度为0.64 g/L。

A.重组COE蛋白SDS-PAGE鉴定结果(M.蛋白Marker；1.未诱导的pET-32a(+)-COE；2.诱导的pET-32a(+)-COE；3.pET-32a(+)-COE诱导上清；4.pET-32a(+)-COE诱导沉淀；5.纯化的COE蛋白)；B.重组COE-Col蛋白SDS-PAGE鉴定结果(M.蛋白Marker；1.未诱导的pET-32a(+)-COE-Col；2.诱导的pET-32a(+)-COE-Col；3.pET-32a(+)-COE-Col诱导上清；4.pET-32a(+)-COE-Col诱导沉淀；5.纯化的COE-Col蛋白)图5 重组COE和COE-Col蛋白诱导表达

2.5 重组蛋白理化性质和结构使用ProtParam工具预测蛋白理化性质，结果COE蛋白含有140个氨基酸，分子式为C686H1022N164O215S4，蛋白相对分子质量约为15 134.87，等电点理论值为4.78，平均亲水性为0.151，预测该蛋白为疏水性蛋白。COE-Col蛋白有156个氨基酸，分子式C762H1141N189O236S4，蛋白相对分子质量约为16 853.81，等电点理论值为5.82，平均亲水性为0.059，预测该蛋白为疏水性蛋白。使用SOPMA预测COE蛋白的二级结构显示其含有5.00% α螺旋，45.00%延伸链，2.86% β转角及47.14%无规则卷曲(图6A)；COE-Col蛋白含有4.49% α螺旋，38.46%延伸链，2.56% β转角及54.49%无规则卷曲(图6B)，2个重组蛋白均不易形成β折叠。使用SWISS-MODEL预测重组蛋白的三级结构，结果显示COE和COE-Col蛋白均主要由无规则卷曲和延伸链组成，与预测的二级结构结果相类似。

A.重组COE蛋白预测结果；B.重组COE-Col蛋白预测结果；红线.延伸链；蓝线.α螺旋；绿线.β转角；紫线.无规则卷曲图6 重组COE和COE-Col蛋白二级结构预测

3 讨论

新生哺乳仔猪由于免疫系统不成熟，感染PEDV后会出现急性腹泻等症状，还会使妊娠母猪腹泻、无乳和生殖周期异常[22]。PEDV主要通过猪的肠黏膜进入宿主体内，在猪小肠的绒毛上皮细胞中复制，并且毒株会不断变异，可能会逃逸现有疫苗的预防体系，因此开发能够诱导强有力的体液和黏膜免疫反应的黏膜疫苗是非常需要的。为了提高疫苗抗原在黏膜免疫组织的传递效率，近年来提出了一种使用M细胞的靶向黏膜疫苗，以定点靶向性的增强黏膜免疫反应。利用M细胞靶向性开发黏膜免疫疫苗已经有很多报道，比如微折叠细胞依赖性抗原转运并通过诱导抗原特异性细胞免疫缓解感染性结肠炎[23]；使用M细胞表面受体C5aR与其配体Col设计口蹄疫靶向疫苗，激发了局部黏膜免疫应答和全身性免疫应答[24]；使用M细胞表面的GP2受体，特异性地与细菌外膜Ⅰ型菌毛(FimH)结合，开发了M细胞靶向性病毒性心肌炎疫苗，显著增强了T细胞免疫应答和黏膜IgA的分泌[25]。由此可见，利用M细胞表面的特异性受体开发靶向性疫苗来诱导高效的抗原特异性免疫应答，提高疫苗的传递和利用效率已经成为制备黏膜免疫疫苗的一种重要手段。

本试验使用的是PEDV S蛋白中S1区段的核心中心表位，若使用S2区段中的某个中和表位或S2区段全长来表达蛋白也可以进行试验。由于PEDV的S蛋白是一种高度糖基化的蛋白，也是一种三聚体跨膜蛋白，因此本试验所使用的原核表达系统中有一定的挑战性，重组表达载体诱导之后蛋白表达量较少，但纯化浓缩后质量浓度有所提高。除了原核表达，还可以采用酵母表达系统诱导蛋白表达，可以分泌目的蛋白到菌体外，操作方便，探索合适的分泌信号肽、强启动元件等可能会影响蛋白表达量，这都将为后续结合利用M细胞靶向性治疗PED及其他疾病提供方向。

本试验将M细胞靶向肽Col基因插入至PEDVCOE基因的C端，从而使PEDV抗原COE靶向到M细胞表面特异性受体，发挥M细胞向黏膜免疫系统输送抗原的递送作用。设计引物克隆COE和COE-Col基因序列，并构建了原核表达载体pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col。将其转化到大肠杆菌TransB(DE3)中进行 IPTG 诱导和SDS-PAGE验证蛋白为包涵体表达后，使用HisTrapTMFF Crude 亲和层析柱纯化并进行复性浓缩，最终得到了单一条带的目的蛋白，为后续制备利用M细胞递送PEDV抗原的靶向疫苗奠定基础。