水稻表达HA蛋白为探针研制H9亚型禽流感抗体半定量快速检测试纸

李雪洋，牛香香，许倩茹，杨继飞，王雅楠，张申立，屈小天，陈金炫，张二芹*，张改平,* (.河南农业大学 动物医学院 国家动物免疫学国际联合研究中心，河南 郑州 006;.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 000;.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 700;.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 006;.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 006)

H9N2亚型禽流感(avian influenza,AI)是由低致病性禽流感病毒(AIV)引起的高度接触性传染疾病[1]。H9N2 AIV于1966年首次从美国分离出来[2]，随后在世界各地广泛传播[3-4]。我国于1994年在广东首次分离到H9N2 AIV[5]，目前在鸡鸭中，H9N2已经取代H5N6和H7N9成为重要的AIV亚型。而且H7N9、H9N9、H9N6、H5N6等新型基因重组和变异亚型不断在禽类群体中出现和传播[6]。所有日龄鸡均易受感染，引起产蛋减少和继发感染，导致免疫抑制，给家禽养殖业造成了巨大的经济损失[7-10]。此外，几乎所有H9亚型AIV以及许多H7N9和H6N2毒株更倾向于人型受体，这增加了人类感染的风险，因此对公众健康造成威胁[11-14]。AIV属于正黏病毒科禽流感病毒属，为单链负RNA病毒。它由8个独立的RNA片段组成，编码结构蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，聚合酶蛋白PB1、PB2和PA，核蛋白(NP)和基质蛋白M1和M2，以及2个非结构蛋白NS1和NS2，在所有的蛋白中，HA蛋白是AIV最重要的保护抗原，它可以诱导机体产生中和抗体，能中和病毒[15]。

目前接种疫苗是预防和控制H9N2 AIV的主要措施[16-17]。监测抗体水平是评价疫苗免疫效果和预防发病最有效的方法。检测H9N2亚型AI抗体最常用的方法[18-21]有血凝抑制试验(hemagglutination inhibition test，HI)、琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion,AGID)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELI-SA)，这些方法具有较高的准确性和特异性,但需要熟练的技术人员或昂贵的设备,因此需要一种简单而快速的方法来检测鸡群AI抗体水平，胶体金检测试纸条能满足这些需求[22]。在过去的几十年中，胶体金检测试纸条已广泛用于非法药物残留的检测和疾病诊断[23-25]。本试验根据《2020年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》和GB/T 18936-2020《高致病性禽流感诊断技术》[20-21]，检测鸡血清时，HI抗体效价不低于1∶16(24或4 log2)，判为阳性，不高于1∶8(23或3 log2)判为阴性。根据这个标准，利用水稻胚乳表达的重组HA蛋白[26]制备胶体金探针，以HA多抗和兔抗鸡IgG抗作为质控线和检测线，组装半定量检测试纸,用于鸡血清H9 AIV抗体检测和评估AI疫苗免疫效果，为鸡能否抵抗AIV攻击提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂三水合氯化金购自美国Sigma Aldrich公司；硝化纤维膜、过滤膜、玻璃滤样垫、吸收垫均购自美国Millipore公司；兔抗鸡纯化IgG购自北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡二抗购自武汉Abbkine公司；H9 AIV血凝抑制试验抗原、标准阳性抗体购自哈尔滨维科生物技术有限公司；重组H9N2 的HA蛋白水稻种子、抗H9 AIV多抗血清、H9 AIV标准阴性血清、H5 AIV和新城疫病毒(NDV)阳性血清由国家动物免疫学联合研究中心保存；传染性法氏囊病病毒(IBDV)和马立克病病毒(MDV)阳性血清由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；Q阴离子填料购自博格隆(上海)生物技术有限公司。

1.2 重组HA蛋白的纯化与鉴定将含H9N2亚型的HA蛋白水稻种子[26]脱壳磨粉，加入提取液(50 mmol/L Tris、10 mmol/L NaCl，pH 9.0)按1∶5混和，室温搅拌1.5 h，4℃ 12 000×g离心20 min，取上清过滤得到粗提液。其经过Q阴离子和HA单克隆抗体亲和纯化得到重组HA蛋白。经SDS-PAGE和Western blot鉴定HA蛋白纯后送上海生工进行质谱鉴定HA蛋白氨基酸序列。

1.3 胶体金标记HA蛋白

1.3.1胶体金的制备[27]将1 mL 1%三水合氯化金(HAuCl4)加入到100 mL超纯水中，加热至沸腾。其次加入3 mL 1%柠檬酸三钠溶液，搅拌至混合物颜色由黄色变为酒红色，再煮5 min，冷却至室温；用0.2 mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH值为8.2，用紫外分光光度计测胶体金的粒径，室温避光保存。

1.3.2胶体金与蛋白偶联 用超纯水将纯化的HA蛋白倍比稀释为0.500，0.250，0.125，0.063，0.032 g/L 5个梯度质量浓度，分别加入125 μL胶体金溶液，室温偶联10 min后，每孔加入10% NaCl溶液125 μL，胶体金颜色不变的HA蛋白最大稀释倍数为蛋白最佳标金量。在胶体金溶液中加入适量HA蛋白溶液，室温偶联30 min，再加入10% BSA溶液阻断非特异性活性位点，相互作用30 min后，于 4℃ 12 000×g离心30 min，弃上清。最后用HB溶液(20 mmol/L硼酸缓冲液，pH 9.0)、1% BSA、2%蔗糖、0.1% TritonX-100和0.1%叠氮化钠重悬金标HA蛋白，4℃保存备用。

1.4 检测线包被质量浓度的确定依据GB/T 18936-2020《高致病性禽流感诊断技术》，HI抗体效价不低于4 log2，判为阳性，不高于3 log2判为阴性。根据这个标准，以胶体金标HA蛋白量和1.2 g/L HA多抗作为质控线的量为基准，将兔抗鸡多抗按照质量浓度2.00，1.00，0.50，0.25 g/L进行倍比稀释，稀释后的多抗包被在硝酸纤维素(NC)膜分别作为检测线，用HI效价为4 log2阳性血清对试纸条进行检测，以看到检测线的最大稀释倍数即为最适包被质量浓度。

1.5 半定量试纸的组装将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫按照顺序依次粘贴到支撑底板上。组装好的试纸条经过切割、外壳装配，放到含有干燥剂的密封袋保存，用于检测抗体(图1)。

A.试纸的组装；B.测试过程中各种检测结果(C.质控线；T.检测线)图1 免疫层析试纸条示意图

1.6 检测程序取待检血清用生理盐水1∶100稀释，吸取100 μL加入96孔ELISA板中，将试纸条插入被检样品中，反应10 min左右观察结果。试纸条的检测线和质控线同时呈红色，被检测的血清判为阳性；只有质控线为红色，血清判为阴性；如只有测试线出现红色或2条线没有颜色变化则试纸条无效，需要重新制备试纸进行检测。

1.7 半定量试纸条特异性试验取AIV H9N2、AIV H5N1、NDV、IBDV和MDV阳性血清以及H9N2标准阴性血清，生理盐水1∶100稀释，同时用TSR3000读卡器检测不同血清样品产生的相对光密度 (ROD)值，检测半定量试纸的特异性。

1.8 半定量试纸条灵敏性试验取AIV H9N2标准阳性血清，用生理盐水从1∶100倍比稀释至1∶51 200，混匀后各取100 μL，加到12联排管中进行检测，10 min后判断试纸的灵敏性。

1.9 半定量试纸条稳定性试验将组装好的试纸室温密封保存 6个月，每个月用AIV H9N2标准阳性血清和AIV H9N2阴性血清检测试纸的检出限，判断试纸的稳定性。

1.10 半定量试纸条与HI试验对比试验取298份来源于免疫或感染临床血清，分别用试纸和HI进行检测，统计2种方法检测结果，最后利用Kappa统计方法[28]评价2种方法的符合率。

2 结果

2.1 水稻表达HA蛋白的纯化与鉴定水稻中HA蛋白经过提取、Q阴离子填料和HA单克隆抗体亲和纯化，经SDS-PAGE电泳，在130 kDa的位置有1条带；用H9N2单抗进行Western blot鉴定，60,80和130 kDa的位置都有反应条带。经质谱鉴定，3条带都为HA蛋白，HA蛋白达到90%以上(图2)。

A.SDS-PAGE(M.蛋白Marker；1.纯化HA蛋白；2.HA蛋白粗提液)； B.Western blot(M.蛋白Marker；1.纯化HA蛋白；2.HA蛋白粗提液)图2 SDS-PAGE和Western blot检测纯化HA蛋白

2.2 胶体金粒径利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用紫外分光光度计对胶体金大小进行估算，结果(图3)： 在525 nm处有1个吸光度值最大的峰，表明胶体金平均粒径约为24.5 nm，适于标记蛋白。

图3 分光光度计扫描胶体金结果

2.3 蛋白最佳标记量与检测线最适包被质量浓度用超纯水倍比稀释HA重组蛋白，加入胶体金和10% NaCl，观察胶体金颜色，结果HA蛋白最佳标记量为30 mg/L胶体金。依据GB/T 18936-2020《高致病性禽流感诊断技术》，HI抗体效价不低于4 log2，判为阳性，不高于3 log2判为阴性。根据这个标准，用HI效价为4 log2阳性血清对试纸条进行检测，试验表明：兔抗鸡IgG最佳包被质量浓度为1 g/L。

2.4 特异性检测为验证试纸的特异性，对不同病毒血清样品进行检测。图4A中显示IBDV、NDV、MDV、AIV H5和阴性血清在质控线上呈现红色条带，只有AIV H9阳性血清在质控线和测试线出现红色条带。试纸检测结果用TSR3000读卡器显示试纸的ROD值，图4B左边的峰值是H9阴、阳性血清、H5N1 AIV、NDV、IBDV和MDV阳性血清质控线的扫描结果，右面的峰值是AIV H9阳性血清测试线扫描结果。以上结果表明：该试纸条特异性好，与其他病毒的抗体无交叉反应性。

A.试纸条特异性检测肉眼观察图(1～6.分别对应H9阳性血清、H9阴性血清、H5N1 AIV、NDV、IBDV和MDV阳性血清)；B.试纸条特异性TSR3000扫描图(1～6.分别对应H9阳性血清、H9阴性血清、H5N1 AIV、NDV、IBDV和MDV阳性血清)图4 试纸条特异性检测

2.5 灵敏性检测为检测试纸的灵敏性，将H9N2标准阳性血清(HI=11 log2)按1∶100,1∶200,1∶400，1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶12 800,1∶25 600和1∶51 200进行稀释，确定试纸的检出限。

结果如图5，当血清稀释到1∶12 800时，试纸仍能检测到阳性血清，说明试纸的灵敏度高。

1～10.分别为1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶12 800,1∶25 600,1∶51 200稀释阳性血清图5 试纸条灵敏性检测

2.6 稳定性检测试纸条放于室温保存，检测其稳定性。结果如表1， 0～6个月抗体阳性检出限均为1∶12 800，阴性血清无效价(表1)。测试结果没有变化，说明试纸稳定性良好。

表1 试纸条稳定性检测

2.7 胶体金试纸条与HI方法的比较应用298份临床鸡血清，比较试纸条与HI试验检测结果。根据检测结果HI效价可将其分为阴性组(20～23)、弱阳组(24～26)、强阳组(27及以上)。表2总结了临床鸡血清检测的结果,阴性组、弱阳组、强阳组分别有69，81，120份与试纸结果一致，强阳组2种方法的符合率最高。结果表明，试纸与HI试验的总符合率为90.6%，Kappa值为0.759，两者一致性较高。

表2 试纸条与HI比对结果 份

3 讨论

H9N2是中国鸡鸭流感的主要流行亚型，自2009年以来，饲养家禽工人的感染率一直在上升。因此，为了畜牧业和公共卫生的安全，应更密切地持续监测AIV[6]。HA蛋白作为产生中和抗体的主要抗原，不仅被用于疫苗研究，而且是区分不同亚型AIV的主要靶点。

虽然已有报道检测H9亚型抗体的免疫层析试纸[29-30]，YANG等[19]和邵雨[31]都是用原核表达系统表HA蛋白，其缺点是蛋白不能正确的折叠和修饰，活性不高。制备试纸检测血清与HI试验结果的符合率分别为80.56%和81.78%。因此试纸定量检测的准确率有待提高，而且定量检测需要额外的仪器检测并对这些数据进行比对分析，这实际上延长了检测时间，限制了试纸条的实际应用。本研究首次用水稻胚乳中表达的HA蛋白进行金标记，制备抗体检测试纸条。由于水稻是真核表达系统，其表达的HA蛋白经过更完善的加工和修饰，因此HA蛋白的活性更强，不受动物相关污染物的污染。此外，重组HA蛋白经Q阴离子和单抗亲和纯化后，纯度达到90%，以上这些确保试纸检测H9N2抗体的特异性和灵敏度没有受到宿主蛋白质和其他因素的影响。一般情况下，测试条灵敏度高，只能用于定性分析，为了使检测条具有更强的临床鉴别价值，本试验尝试对禽流感抗体检测条进行升级，使检测范围与HI一致。根据《高致病性禽流感诊断技术》标准，HI抗体效价大于等于4 log2，则判定为阳性；HI小于3 log2，则判定为阴性。为了解决试纸半定量的问题，对蛋白最佳标金量和T线包被质量浓度进行摸索，最终确定最佳标记量为30 mg/L胶体金。其次对T线包被质量浓度进行梯度摸索，对多个实验室保存的H9阳性血清(HI=4 log2)1∶100稀释样品进行检测，最终确定T线最佳包被质量浓度1 g/L，C线为1.2 g/L，实现了试纸条对临床样品的半定量检测。

本试验为了验证制备的H9 AIV抗体检测条具有较高的特异性，检测了不同的血清，包括NDV、MDV、IBDV、AIV H5和阴性血清，结果显示H9N2抗体试纸条与其他血清无交叉反应。不同样品的相对光密度(ROD)检测结果与上述特异性结果一致。在灵敏性试验中，禽流感N9N2阳性血清稀释到1∶12 800，试纸仍能检测到，说明试纸的灵敏性较高。将试纸置于室温保存6个月后，用1∶12 800稀释的血清进行检测，则没有变化。应用试纸与HI检测分别检测298份临床血清，两者重叠率为90.6%，Kappa统计值为0.759。这表明2种方法的一致性较高，试纸的准确率较高。该试纸可以作为HI试验的替代品，以确定临床免疫鸡H9N2禽流感疫苗的有效性。综上所述，本研究成功研制出一种简单、快速、准确、特异的H9 AIV抗体检测试纸条，为临床大规模监测H9亚型禽流感疫苗免疫效果提供了一种新的策略，具有潜在的商业应用价值。