仔猪肠道菌群演替规律及其影响因素研究进展

俞添贺，李 响，宋战昀，王向辉，刘 博，王 准，魏 箐，肖 芳，龚 贺，冯 新* (.吉林大学 动物医学学院,吉林 长春 006； .长春海关 技术中心，吉林 长春 006； .哈尔滨海关 技术中心,黑龙江 哈尔滨 500)

仔猪的肠道中存在着能够与仔猪互利共生、相互影响的微生物菌群。这些微生物在仔猪肠道内构成一个微生态平衡，这种平衡在机体营养物质代谢、生长发育和抗病能力等方面都发挥着十分重要的作用，其相关研究已经得到了越来越多的关注[1]。这些菌群常常被认为是仔猪的一个“器官”，在仔猪生长、繁殖等代谢过程中，这些微生物具有仔猪本身器官所没有的功能，如通过调节肠道菌群组成来减少猪脂肪沉积等[2]。但是，在仔猪的整个生长发育过程当中，其肠道菌群不可避免地受到饲养环境、饮食、应激等诸多因素的影响，所以，保证仔猪肠道菌群的健康对维持机体正常的生理代谢具有极其重要的意义[3]。随着培养组学的不断发展，猪肠道中能够直接引起表型变化和疾病发生的菌株将会被逐渐鉴别[4]。仔猪大肠发达，其中存在的大量微生物对所采食的物质进行消化吸收，如高纤维物质、脂肪、不溶性蛋白质等，这些难消化的物质经过微生物发酵后能够产生营养物质给机体提供营养。仔猪肠道菌群相关影响因素的研究，对仔猪疾病预防、促进仔猪生长发育意义重大。刘家奇等[5]研究发现，对动物肠道菌群进行调节能够抑制中枢神经系统疾病的发展,并提高宿主抗病能力进而改善宿主健康状况。刘红南等[6]研究表明，通过对功能性饲料的优化使用，能够为宿主后肠道菌群提供更好地利用氮的环境，提高氮利用率以降低畜禽氨气的产生，进而可改善大气质量。对于仔猪肠道菌群定植、发展、演替规律、多样性以及影响因素的研究，能够为仔猪的科学饲养及管理提供帮助。

1 仔猪肠道菌群的演替规律及多样性

仔猪肠道菌群的发展、定植是动态变化的过程，对于仔猪成长的每个阶段，肠道内都会有相应的菌群发挥作用。仔猪肠道菌群包括肠道内的古细菌、真菌、原生动物菌、细菌、病毒等。在猪的长期进化过程中，肠道内菌群的平衡能够得以维持正是因为肠道内微生物发挥着作用，这种平衡对于仔猪生长、发育有着重要作用。开展仔猪肠道菌群的研究，对于促进仔猪生长发育具有重要意义。

1.1 仔猪肠道菌群发生、发展演替规律仔猪肠道菌群并不是与生俱来的，而是在仔猪出生后，通过与母猪生殖道、皮肤、粪便等的接触而获得的，并且在后天生长发育过程中逐步形成(图1)。健康母猪的消化道菌群，将对新生仔猪的肠道发育和屏障功能产生重要影响[7]。在仔猪生长发育的不同阶段，其肠道菌群的组成有着非常大的差别。随着仔猪日龄的不断增加，其肠道菌群也发生一定规律的变化[8]。杨柳等[9]研究表明，仔猪在母体内处在一种无菌的状态，在仔猪分娩以后，因为受到母猪产道微生物和空气中微生物的影响，肠道内才开始定植微生物。但是，李浩等[10]表明，仔猪在胚胎时期，由于不可避免的吞饮羊水，其肠道内已经开始定植微生物。在整个仔猪肠道菌群产生的过程当中，历经从无菌到需氧菌到兼性厌氧菌到专性厌氧菌的4个阶段的过程。

图1 仔猪肠道菌群母源传递示意图

仔猪肠道中能够帮助仔猪利用母乳中营养成分的细菌为乳酸杆菌与链球菌。仔猪断奶后，肠道菌群的组成也会发生改变，经历从简单到复杂的变化[11]。大肠杆菌数量在仔猪出生的12 h呈现优势；仔猪在出生48 h后，乳酸菌和链球菌数量逐渐呈现优势[12]。而断奶仔猪肠道中的菌群又发生了非常大的变化，拟杆菌属细菌逐渐成为主要的厌氧菌群[13]。由此可知，仔猪肠道菌群是按照一定顺序建立起来的，并且有一定规律的在肠道中变化[14]。仔猪在出生后，极短的时间内就可以在肠道内形成比较成熟的肠道菌群，仔猪个体之间肠道菌群的结构存在差异，但每个仔猪的菌群均能平衡存在[15]。

1.2 猪肠道菌群的多样性动物肠道中的细菌类微生物多达100万亿，这个数量约是机体细胞数量的10倍，其种类多达500种[16-18]。这些微生物主要是细菌，根据这些微生物对于氧气的需求，能够将其分为需氧菌、厌氧菌两类[19]。猪的肠道菌群涉及范围非常广泛，共涉及到25门、47纲、79目、121科、207属和390种[20]。伴随着细菌非培养技术的发展，对仔猪肠道菌群的研究更加地精细化。在仔猪体内肠道的不同位置，其菌群的分布也存在着不同[21]，即使是同一种细菌，在不同肠道位置环境下，其相对丰度也存在显著性差异[22]，这种现象和肠道的不同位置有着不同生理状态和生理功能密切相关。郭晓红等[23]通过高通量测序技术，比较研究A(晋汾白猪)、B(马身猪)2种仔猪在生长发育的不同阶段结肠菌群结构与特征的差异，其肠道菌群分布较为广泛。厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)在结果中呈现优势占比，在3个不同生长发育阶段，平均占比分别达到49%与32%，优势较为明显。在2种仔猪结肠菌群中，厚壁菌门所占比例均逐步增大，且A仔猪厚壁菌门占比随日龄增大程度明显高于B仔猪。A仔猪3个不同生长发育阶段结肠菌群中拟杆菌门占比都在30%左右，但B仔猪3个不同生长发育阶段结肠菌群中拟杆菌门占比呈现由35%到23%再到46%的变化。变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)在2种仔猪从出生到断奶后，在结肠菌群中的占比波动较大，在仔猪出生时，变形菌门在不同品种仔猪结肠菌群中占比差别较大，A仔猪比例(24%)明显高于B仔猪(4%)，而梭杆菌门则表现相反，B仔猪1日龄时占比(28%)则显著高于A仔猪(17%)，如图2所示。对于仔猪肠道优势菌群分布规律的研究所呈现出的结果不是完全相同[24]，仔猪肠道菌群的产生和发展会因为品种、年龄等的不同而发生不一样的变化[25]。

图2 2个品种猪结肠菌群门水平组成分析结果[23]

2 影响仔猪肠道菌群演替变化的内在因素

仔猪从出生到断奶后2周是生长关键期，在这个时间段内肠道菌群定植并初步成熟。仔猪肠道菌群会发生比较剧烈的变化，菌群会随着内外因素的共同影响而发生改变，如饲养环境、食物类型、断奶应激等。不仅如此，肠道菌群建立也是与宿主相互作用和长期自然选择的结果，宿主的遗传因素在菌群的组成和结构上起到了决定性的作用。

2.1 品种动物肠道菌群的基因与人类肠道菌群的基因在遗传性上存在相似性，不同动物品种的肠道菌群基因会存在明显差别。通过对美国人与欧洲人肠道菌群基因的对比研究发现，肠道菌群基因有上千万个单碱基发生变异，样本中的每个人都可以通过肠道菌群的遗传基因进行鉴别。通过对生长在相同环境下的4个品种淡水鱼进行研究发现，4种鱼的肠道菌群多样性存在明显差异。在山羊品种与肠道菌群之间关系的研究中同样发现了这点，对于品种相同的山羊而言，其肠道菌群相似度极高，不同品种山羊的肠道菌群差异较大。

仔猪肠道内菌群因猪品种的不同而存在差异。CHEN等[22]通过对不同年龄、性别、地理区域的野猪和杜洛克猪的样本进行深度宏基因组测序，通过对野猪和高度商业化杜洛克猪2种不同饲养条件下猪的肠道菌群的比较研究，发现2个品种猪肠道菌群在菌种组成上存在差异。双胞胎的肠道菌群相似性比无基因关联的个体间表现得更加明显，而同卵双生比异卵双生肠道菌群相似程度更高，这表明仔猪品种的遗传因素对肠道菌群影响很大。对藏猪与瘦肉型猪肠道菌群组成探究试验发现[26]，藏猪与荣昌猪和大白猪相比，肠道内的厚壁菌和螺旋菌比例更高且拟杆菌的比例更低，藏猪螺旋菌的比例比荣昌猪高出许多；而大白猪、荣昌猪和藏猪相比，肠道内无壁菌的比例更高及纤维杆菌和迷踪菌的比例更低，在藏猪粪便中，乳酸菌的比例显著高于其余2种猪。对民猪和大白猪肠道菌群的比较研究发现，大白猪的厌氧弧菌属比民猪高4.5倍，梭菌属比民猪高3.5倍，民猪的纤维杆菌属比大白猪高出3.6倍，螺旋菌属比大白猪高出1.7倍，密螺旋体属比大白猪高出1.8倍。高鹏飞等[27]对梅山猪与长白猪肠道优势菌门进行比较研究发现，梅山猪肠道优势菌门数量大幅度低于长白猪，但其优势菌门所占比例大幅度高于长白猪。YANG等[28]对国内外8种不同品种的猪肠道菌群进行分析发现，国内体脂含量较高品种猪的肠道菌群类型相近，国外体脂含量较低品种猪的肠道菌群类型相近，且国内体脂含量较高品种猪的肠道菌群类型更多。在猪的肠道菌群中，厚壁菌门、拟杆菌门数量最多，占比在90%以上，其他菌门加在一起平均不到总群落的5%，厚壁菌门、拟杆菌门在不同品种猪的肠道菌群中占比不同(表1)。

表1 不同品种猪肠道优势菌门占比[28] %

在对不同脂肪型猪肠道菌群多样性进行比较研究时发现，金华猪的厚壁菌门相对丰度高于长白猪，而长白猪拟杆菌门的相对丰度高于金华猪；荣昌猪和藏猪的厚壁菌门都比大白猪高，而大白猪的拟杆菌门比荣昌猪和藏猪高，具体数据如表2所示。以上研究足以表明猪的不同品种能够对其肠道菌群多样性产生重要影响。

表2 不同脂肪型猪肠道优势菌门占比[28] %

2.2 日龄动物体内肠道菌群的结构是随着年龄不断变化的。STEFANO等[29]通过对3个不同年龄段人群的粪便样品进行分析研究发现，少年及中年样品中的双歧杆菌、乳酸杆菌含量明显比老年人高。对我国部分地区相同民族不同年龄志愿者的粪便样品进行分析研究发现，不同年龄样品中的优势菌群占比差异较大，哺乳期志愿者样品中双歧杆菌占比明显比青年志愿者样品和中年志愿者样品高，且3组志愿者样品中乳杆菌属占比差异明显[30]。在相同养殖水体和饲粮条件下对不同日龄大黄鱼肠道菌群结构研究发现，不同日龄的大黄鱼分别产生了具有明显差异的肠道菌群[31]。研究年龄与牦牛肠道菌群结构和功能的关系中发现，年龄差异较大的牦牛肠道菌群有较大差别，对于年龄相近的牦牛而言，其肠道菌群差异较小，成年牦牛比犊牦牛肠道菌群类型更加多样。

随着仔猪日龄的增长，肠道菌群的多样性也随着发生变化，仔猪肠道菌群变得越来越复杂，其数量趋于稳定[32]。NIU等[33]研究发现，仔猪肠道菌群的多样性与仔猪日龄存在紧密的关联。不同品种仔猪之间肠道微生物差异不是十分明显，而仔猪的不同生长时期其肠道菌群类型较为不同[34]。对不同生长发育阶段仔猪肠道菌群差异性研究发现，厚壁菌门丰度呈先升后降的变化，从60日龄到120日龄逐渐上升(76.22%～91.84%)，从120日龄到180日龄逐渐下降(91.84%～72.05%)；拟杆菌门丰度呈先降后升的变化，从60日龄到120日龄逐渐下降(19.47%～5.34%)，从120日龄到180日龄又逐渐上升(5.34%～8.46%)；螺旋体门(Spirochaetae)所占比例越来越大，从60日龄到180日龄明显增加(0.21%～17.82%)[35]，具体数据如表3所示。

表3 不同日龄猪肠道优势菌门占比[35] %

3 小结与展望

猪的肠道菌群受品种、日龄等多种因素的影响。对仔猪整个生命周期中肠道菌群的纵向变化过程和仔猪成长每个阶段肠道菌群主要影响因素的深入研究十分必要。较多研究确定仔猪肠道菌群影响宿主的健康，但是对于肠道菌群的深入研究仍然停留在菌群组成与表型相关联的研究，对于肠道菌群在仔猪整个生命周期中不断变化的演替过程和对仔猪生长发育的直接影响机制的研究还不是很多，此研究方向依然有很多不确定性和局限性。对于猪肠道菌群相关性的研究较多，但是很多研究的机理尚不明确，在这样的情况下，很难将相关性研究的原因和结果加以区分，并对机理加以借鉴和应用。

我国是全世界公认的生猪生产和猪肉消费大国，但我国的生猪养殖产业还存在着诸多问题，如相关疾病的防制、饲料利用率不高，对自然环境影响较大等。随着禁抗时代的到来，找到能够替代抗生素的行之有效的疫病防制方法至关重要，肠道菌群方面的研究提供了一个新的思路。传统的食品安全研究主要集中在屠宰之后，包括屠宰、分装、储藏、运输和后期的批发零售，并且集中在一种或几种食源性致病菌上，猪肠道菌群的研究，可以为食品安全研究拓展到屠宰之前，同时，也能够为食品安全研究提供一个比较完整的致病菌图谱。

通过对仔猪肠道菌群的不断探索，发现肠道菌群在调节仔猪健康和控制疾病等方面发挥着非常重要的作用，人工干预肠道菌群以增强仔猪的健康状况的方法，其应用前景十分广阔。如通过人工移植的方式，把健康动物的粪便菌液经过加工后，利用消化道途径给予受体动物，通过干预受体动物肠道菌群结构以达到预期效果，这样的方法是目前该领域研究的热点，此方法对受体动物具有先天性优势，与其他的干预方法相比较，更加的安全、环保。粪便菌群对于大肠肠腔内的菌群有较强的代表性，对于其他肠段(如小肠)的菌群代表性极弱，因此目前较为常见的粪菌移植可能仅对大肠菌群有明显的干预作用，而对于具有重要生理功能的小肠菌群影响不大。LI等[36]的研究首次证明了不同肠段的菌群定植具有区域特异性，即源于大肠的菌群易定植于大肠，而小肠的菌群易定植于小肠。该研究通过进一步对比分析常规粪菌移植(FMT)和全肠菌群移植(WIMT)在塑造无菌动物不同肠道段菌群方面的差异，表明WIMT更有助于小肠菌群的植入。因此，WIMT或能作为FMT的替代方法，对不同肠道区域的菌群进行更加精确和目的性的干预。

在猪肠道菌群的研究上，一些基础的生态学、生理学方面的问题亟待解决，如：调控猪肠道菌群的主要因子是什么?调控猪肠道菌群的最佳时间是什么？猪肠道内哪些是常驻菌、哪些是过路菌？猪肠道内是否存在一个核心菌群？猪肠道菌群的定植是否存在优先效应？加大对基础学中的生态学、生理学相关方面的研究，不仅能对以上问题加以阐释、解答。同时能够总结出一套以大数据相关性分析、细菌培养组学、益生菌培养、动物试验验证为主要程序的技术体系，以此来进一步阐释猪、肠道菌群、饲料及环境之间的相互作用关系。

目前，对于猪肠道菌群组的深入研究仍然较少，其主要原因是由于缺少猪肠道菌群组较为全面的基因组目录，因此宏基因组测序结果不能做到有效的检测和分析。黄路生院士团队通过对不同来源的猪肠道菌群组深度宏基因组测序并对现有猪肠道菌群基因组进行整合，重新构建了一个目前较为完整的猪肠道菌群基因目录(PIGC)和基于宏基因组组装的基因组(MAG)。该研究中构建的基因组为深入了解猪肠道微生物组和未来基于宏基因组测序的研究提供了重要而有力的资源。随着培养组学技术、高通量测序技术的持续发展，在研究肠道菌群组成、结构的同时，深入了解其对宿主动态影响的机制，并加以良性利用，可保证仔猪肠道健康，促进仔猪生长发育。综上所述，利用干预肠道菌群技术来增强猪的生产性能和提高猪的健康水平具有较大操作难度，但其应用前景十分广阔。