马非手术法胚胎移植技术体系的建立

张志鹏，孙旺吾，刘羿羿，周欢敏* (.内蒙古农业大学 生命科学院 内蒙古自治区生物制造重点实验室，内蒙古 呼和浩特 0008；.山东省莱西市第一中学，山东 莱西 66000)

与牛[1]、羊[2]等家畜相比，马的胚胎移植技术研究起步较晚。1972年，日本最先成功完成马胚胎的收集和移植，是马胚胎移植技术研究成功的先驱[3]。1990年，非手术胚胎移植技术研究成功，并进行了规模化的生产[4]。2015年，国际胚胎移植学会报告称[5]，全球共有20 924匹马接受了胚胎移植。我国对马胚胎移植技术的研究较少，1982年，马玉斌等[6]通过非手术法采集到6枚胚胎，胚胎移植成功率为33.3%(2/6)。2005年，新疆畜牧研究院[7]报道了马非手术法胚胎移植技术的研究，冲胚率为58.3%，移植成功率为30.8%(4/13)。2012年，青岛农业大学[8]利用胚胎移植技术繁育国外品种马，生产了6匹马驹。

我国现代马术用马的匮乏，成为我国马产业发展的重要制约因素[9]。胚胎移植是马繁育的一种辅助生殖技术，从有价值的供体母马身上采集可繁殖胚胎，移植到受体母马体内，使受体母马怀孕至生产马驹，可以克服距离、竞技比赛、生殖健康和时间的限制，使供体母马在1年内产下多个小马驹[10]。因此，本研究针对国内优良现代马术用马市场需求，开展马胚胎移植技术体系的研究，探讨母马发情和排卵鉴定与调控、公马的采精与人工授精、非手术法胚胎采集与鉴定、非手术法胚胎移植、孕马的妊娠诊断等技术环节，建立了马胚胎移植技术体系，获得稳定的人工授精、胚胎移植成功率，在提升我国的马繁育技术的同时，可满足国内市场对现代马术用马需求。

1 材料与方法

1.1 试验材料青岛海氏海诺集团莱河大自然农场有限公司(以下简称海诺农场)内的3匹公马(汉诺威马、塞拉-法兰西马和荷兰温血马各1匹)、12匹供体母马(汉诺威马5匹、塞拉-法兰西马4匹和荷兰温血马3匹)和81匹国内品种马(受体母马)。

1.2 母马发情调控母马排卵后第5 天，连续2 d肌肉注射0.2 mg PGF2α或1 500 IU PMSG，每组30匹母马，在注射激素后2，9 d(即母马排卵后第7，14 天)检测母马发情情况。

1.3 母马排卵调控母马卵泡直径≥30 mm时，静脉注射1 500 IU hCG或肌肉注射300 IU FSH+200 IU LH，每组19匹母马，每12 h检测母马的排卵情况。

1.4 人工授精牵引公马爬跨假台马的方法进行采精后，进行精液的品质检测，然后使用无菌宫内输精管进行人工输精，选取子宫、子宫角和自然交配3种不同的授精方式，探讨母马受孕率的情况。每组10匹母马，下午15:00至16:00进行不同方式的输精试验。

1.5 非手术法采集胚胎本试验选用“点滴式”进行冲胚，“Y”型管带气囊一端进入母马子宫，另一端连接冲胚液和集胚皿，每次向子宫灌注1 L 冲胚液，结束胚胎采集后，将胚胎过滤器放在体视显微镜下捡胚。本试验选择乳酸钠林格注射液和EURO FLUSH冲胚液2种不同的液体作为冲胚液，探讨不同的冲胚液的采集效率。

1.6 非手术法胚胎移植本研究选取3种胚胎保存液，探讨不同的胚胎保存液对胚胎移植成功率的影响。试验1组为实验室制备胚胎保存液(HN-EHM)，包含M199、10.0% FBS、0.01 UI/mL FSH、0.01 UI/mL LH、200 μg/L IGF-I、0.05 g/LL-谷氨酰胺、1.0 %双抗；试验2组为IMV胚胎保存液；试验3组为乳酸钠林格注射液。3个试验组分别选用6孔培养皿每孔放入1 mL胚胎保存液，胚胎清洗5遍后进行胚胎装管，最后将胚胎移入母马子宫中。

1.7 妊娠诊断本研究选取B超检查法诊断母马的妊娠情况，母马授精后9，12，14，17，27，45 d，利用B超仪对孕马进行妊娠诊断。

2 结果

2.1 母马的排卵检查结果B超检测卵泡发育的影像，如图1A所示，排卵后2 d，卵泡直径较小(f)，存在明显的黄体。排卵后3～10 d，卵泡的直径波动不大(图1B)，仍能发现明显的黄体(CL)。到14 d，黄体明显变小甚至消失(图1C)，卵泡的直径变大，出现发情现象。18～20 d(图1D)，黄体完全溶解，卵泡生长到(42.3±3.6) mm。即将发生排卵的卵泡(图1E)，卵泡直径增长到45.0 mm左右，卵泡壁变薄，但形状仍然处于规则状态。图1F显示正在或即将发生排卵的卵泡，直径变小，卵泡变形。

A.排卵后2 d卵泡图像；B.排卵后3～10 d卵泡图像；C.排卵后14 d卵泡图像；D.排卵后18～20 d卵泡图像；E.即将排卵卵泡的图像；F.正在排卵的卵泡。CL.卵巢黄体；f.卵巢卵泡。超声波B超仪(KX5000)探头为7.5 MHz L40线阵宽频探头(频率范围6.0～9.0 MHz，中心频率7.5 MHz)图1 卵泡发育过程和直径变化

2.2 不同激素诱导母马发情的结果本试验对试验母马注射不同种类的激素，处理后2 d(即母马排卵后7 d)，肌肉注射0.2 mg PGF2α组、肌肉注射1 500 IU PMSG组和对照组(自然发情)的发情比例分别是63.2%，47.2%，0.0%(自然发情试验组没有母马发情)，3个试验组差异显著(P<0.05)。3个试验组注射相应的激素后9 d(即母马排卵后14 d)，检测3组的发情比例分别是94.7%，89.2%,78.9%，PGF2α试验组显著高于对照组(P<0.05)。PGF2α能够有效的诱导母马发情，汉诺威马、赛拉-法兰西马、荷兰温血马和国内品种马(受体马)的发情周期分别由(21.1±2.8)，(21.9±2.2)，(21.3±3.3),(21.6±2.4) d，缩短至(11.7±3.1)，(12.2±2.8)，(11.5±1.9),(12.7±2.3) d。

2.3 不同激素调控马排卵的比例B超测得卵泡直径≥30 mm时，静脉注射1 500 IU hCG、肌肉注射300 IU FSH + 200 IU LH组和对照组(自然排卵)，如图2A、B所示，48 h内，排卵比例分别是84.2%(16/19)，31.6%(6/19)，15.8%(3/19)，三者差异显著(P<0.05)。60，72 h的排卵比例如图2C、D所示，3个试验组马的排卵比例分别是10.5%(2/19)，42.1%(8/19)，21.1%(4/19)和5.3%(1/19)，21.1%(4/19)，36.8%(7/19)，3个试验组马排卵比例差异显著(P<0.05)。本试验可以得出，hCG能够有效调节母马的排卵，84.2%的母马在36～48 h内排卵。

A.36 h母马排卵比例；B.48 h母马排卵比例；C.60 h母马排卵比例；D.72 h母马排卵比例图2 卵泡排卵调控的结果

2.4 不同输精方式对母马受孕率的影响本试验选取不同的输精方式，探讨母马的受孕率情况，结果如图3A所示，子宫角和子宫输精的母马受孕率分别是95.1%(39/41)和91.9%(34/37)，显著高于自然交配的56.2%(9/16)(P<0.05)。3个试验组的情期受胎率分别是85.4%(36/41)，78.4%(29/37)，25.0%(4/16)，差异显著(P<0.05)。3种不同的繁育方式所用的输精次数没有显著性差异(图3B)，分别为(2.3±0.6)，(1.7±0.6)，(2.8±0.7)次(P>0.05)。与传统的输精方式相比，本试验通过子宫角输精的精液使用量为(9.3±1.1) mL(图3C)，显著低于传统的子宫输精量(18.4±2.5) mL(P<0.05)。子宫输精和子宫角输精孕马流产率不高(图3D)，分别是2.9%(1/34)和2.6%(1/39)，低于自然交配的22.2%(2/9)。

A.不同输精方式母马受孕率；B.不同输精方式输精次数；C.不同输精方式精液量；D.不同输精方式孕马流产率图3 不同输精方式对比

2.5 不同冲胚液对胚胎收集效率的影响乳酸钠林格注射液和EURO FLUSH 冲胚液的采集胚胎成功率分别是71.8%(46/64)和70.0%(21/30)，两者差异不显著(P>0.05)。但是，前者的价格(61.6元/次)比后者(480.0元/次)便宜，本试验选取乳酸钠林格作为冲胚液。本试验共进行92匹次胚胎采集(7～8 d)应用研究，成功采集胚胎67匹次，成功率为72.8%，获得75枚胚胎。如图4A所示，4月份有5匹次非手术法采集胚胎试验，数量最少，6月份有23匹次采集胚胎试验，数量最多。每个月份采集胚胎的成功率也不同，如图4B所示，4，5，6月份采集胚胎的成功率超过80.0%，成功率最高的为5月份，达到88.9%(16/18)，而7，8，10月份成功率较低，分别为53.8%(7/13)，54.8%(6/11)，42.9%(3/7)。

A.受体母马不同月份冲胚次数；B.不同月份冲胚成功率;C.不同品种供体母马的冲胚次数图4 冲胚次数

2.6 胚胎移植的成功率本试验通过非手术法进行胚胎采集，共获得75枚囊胚胚胎(8 d)，其中A级胚64枚(图5A)，胚胎的大小适中，透明度优良，细胞紧密排列。B级胚7枚(图5B)，胚胎发育过快或过缓。C级胚4枚(图5C)，胚胎发育阶段与胚龄不一致，细胞结构松散，色泽过暗或过深。自制胚胎保存液(HN-EHM)试验组进行10枚胚胎的移植，8匹受体马受孕，胚胎移植成功率为80.0%。IMV胚胎保存液试验组进行18枚胚胎的移植，15匹受体母马受孕，胚胎移植成功率为83.3%。乳酸钠林格注射液试验组进行8枚胚胎的移植，6匹受体母马受孕，胚胎移植成功率为75.0%，低于其他2组的成功率。本试验进行17匹次早期胚胎(5～6 d)的采集试验，成功冲胚12匹次，成功率为70.6%，获得12枚早期囊胚(图5D)，进行11匹次胚胎移植试验，10匹受体母马受孕，移植成功率为90.9%。

A.8 d非手术法胚胎采集A级胚胎图像；B.8 d B级胚胎图像；C.8 d C级胚胎图像；D.6 d胚胎图像图5 胚胎的质量检测 (×100)

2.7 孕马妊娠诊断的结果B超能够准确检查孕马的胚胎发情情况，在母马受孕后9 d(图6A)精确检查到子宫中胚胎的位置与形状。胚胎发育到11 d时候较小(图6B)，约黄豆粒大小，规则圆形。发育到17 d胚胎呈现三角形状态(图6D)，27 d开始出现心跳(图6E)，45 d胎儿基本成型(图6F)。

A.9 d胚胎发育图像；B.11 d 胚胎发育图像；C.14 d 胚胎发育图像；D.17 d 胚胎发育图像；E.27 d 胚胎发育图像；F.45 d 胚胎发育图像。超声波B超仪(KX5000)探头为7.5 MHz L40线阵宽频探头(频率范围6.0～9.0 MHz，中心频率7.5 MHz)图6 胚胎发育B超检查图像

3 讨论

母马的发情周期平均为21 d(18～25 d)，发情期持续5～7 d，要比其他家畜长得多[11]。一般情况下，马的发情与卵泡生长呈现相关性[12]。有些特殊情况，马处于间情期，卵巢中仍然存有直径较大的卵泡，约25～30 mm；发情期，卵泡直径较小，约15～20 mm[13]。母马发情与卵泡生长的时间可能发生“错位”现象，这就导致了以发情判断为依据的自然交配的效率低，无法提高成功率，仅通过判断母马发情状态进行授精，忽略了卵泡发育状态的重要因素，导致母马受孕率较低[14]。

超数排卵可以促使动物排出多个卵母细胞，通过人为提高体内外源性促卵泡激素的水平，促使多个有腔卵泡发育、成熟和排卵[15]。目前对马超数排卵的研究甚少，仅有个别的试验使用马垂体提取促性腺激素，主要是FSH和LH促进马排卵，并已被证明增加了处理母马的排卵次数[16]。影响马超数排卵的因素主要有两大类：一类是母马自身因素，包括个体和遗传的差异、生理和营养状态、季节及环境因素对母马的影响[17]；另一类是药物因素，包括激素的种类、给药途径、剂量和频率等。卵巢状态是母马主要的自身因素，GUILBAULT 等[18]的研究表明，有优势卵泡存在的前提下，用促性腺激素超排，会降低排卵数量，导致胚胎减少。超数排卵过程中，促卵泡素使用量逐渐降低，与此同时，体内来源的促卵泡素的分泌量降低，由于低量的促卵泡素，后期的卵泡不能发育，导致闭锁[19]。在超数排卵过程中，优势卵泡可能最先排卵，进而产生黄体，分泌孕激素抑制发情，导致了发情和排卵周期性结束[20]。

授精时机的掌握是人工授精成功的关键，与常规输精相比，深部输精且在排卵侧子宫角输精10 mL能够提高马的受胎率。其他动物的输精已经采用深部输精方式，在猪的研究中，深部输精80 mL提高母猪受胎率和分娩率分别为3.23%和3.31%，总产仔猪数提高了0.27头，显著提高出生窝重，降低断奶窝重，但对断奶仔猪数及哺乳成活率影响不显著[21]。在羊的研究中，子宫角输精的受孕率显著高于颈口输精的受孕率，前者的成功率为91.3%，生产率为136.8%(羊是多胎动物)，后者的成功率为36.4%，生产率为100.0%[22]。

目前，冲胚的方式主要有2种，一种是“回流式”，即采胚导管呈现为直筒形式，带有气球一段进入母马子宫，另一端连接装有冲胚液的瓶子，冲胚过程中，回流液直接进入原来装有冲胚液的瓶子中[23]。第二种是本试验使用的方法 “点滴式”冲胚，两者的冲胚成功率没有差异，都在70.0%～85.0% 之间，“回流式”冲胚法主要在德国、比利时等国家应用，“点滴式”冲胚法主要在法国、美国等国家应用[24]。人工授精、胚胎移植试验中，每次不可能保证母马全部受孕，利用B超进行妊娠检测能够更快、更精准的了解马受孕情况。在未孕情况下，本研究要检测母马子宫是否存有液体，有无炎症等情况，以便进行子宫的冲洗工作[25]。

本研究提出一种有效的调控马同期发情的方法，对马的发情、排卵进行有效的调控，突破马子宫角人工授精技术，提高了马的人工授精成功率，完善马非手术法冲胚、胚胎移植技术体系，首次进行桑椹胚的采集与移植技术研究。本研究将与合作单位共同打造国内知名的马繁育、培育、技术研发基地，培育马胚胎移植的核心产业，推动马胚胎移植技术的市场化、产业化，加快现代育马产业的发展。