山羊源无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)的分离鉴定与耐药性分析

李富祥，洪琼花，朱 沛，王金萍，杨仕标，宋建领，高华峰* (.云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 6504；.云南省畜牧兽医科学院 云南省畜禽遗传资源保护和种质创新工程实验室，云南 昆明 6504)

无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacteriumamycolatum)是1988年英国COLLINS等[1]命名的一个种，属于棒状杆菌属的一个成员。C.amycolatum是一种重要的条件致病菌[2]，能引起人的阴道炎[3]、心内膜炎[4]、败血症[5]、腹膜炎[6]、关节炎[7]，乳腺炎[8]和角膜溃疡[9]等多种疾病。到目前为止，仅见美国[4]、英国[7]、德国[5]、中国[3]和土耳其[2]等十多个国家有C.amycolatum分离鉴定的报道，但绝大部分分离株均来自于人，来自动物分离株的报道罕见[9-10]。

2021年8月，云南省弥勒县某规模化羊场发生一种慢性腹泻疾病，头孢类抗生素治疗有一定的效果，但停药后容易再次发生腹泻，该病的发病率为2.0%，病死率为10.0%，给养殖场造成较大的经济损失。为对该病例进行实验室诊断，本研究采集10份腹泻病羊的直肠棉拭子样品进行细菌分离鉴定，结果分离到10株革兰阳性多形杆菌，分离株经形态学和16S rDNA基因同源性比对和遗传进化分析鉴定为C.amycolatum。本研究首次从羊分离到C.amycolatum，并分析分离株的耐药性和耐药基因特征，为羊C.amycolatum感染的预防和控制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂哥伦比亚琼脂、麦康凯琼脂购自北京奥博星生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix和Trans 2K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；青霉素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩、头孢呋辛、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、氯霉素、阿米卡星、诺氟沙星、四环素和磺胺甲恶唑药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；氟苯尼考药敏纸片购自英国OXOID公司。

1.2 引物设计细菌16S rDNA上下游引物27F(A)/1492R(T)参照文献[11]设计；细菌耐药基因引物参照文献[12]设计；引物均由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.3 细菌分离将10份直肠棉拭子样品分别划线接种哥伦比亚琼脂平板，37℃、5.0% CO2培养24 h，挑取优势菌落进行纯培养，将分离株革兰染色镜检，观察菌体形态。同时将分离株接种麦康凯琼脂平板，37℃、5.0% CO2培养24 h，观察生长特性。

1.4 16S rDNA基因测序用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取10株分离株基因组DNA作为PCR模板，采用27F(A)/1492R(T)引物PCR扩增16S rDNA基因，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序，将序列提交GenBank数据库获得基因收录号。

1.5 16S rDNA基因BLAST比对鉴定分别将10株分离株16S rDNA基因在NCBI数据中进行BLAST比对鉴定。

1.6 16S rDNA基因遗传进化分析利用MegAli-gn软件分析分离株与其16S rDNA基因遗传进化相关细菌种的同源性，利用MEGA 4.0.2软件构建16S rDNA基因(1 368 bp)系统进化树(Neighbor-Joining进化树)，bootstrap values值设定为1 000，选择棒状杆菌属模式菌株C.diphtheriaeNCTC 11397T(LN831026)作为进化树的外群，对分离株进行遗传进化分析鉴定。

1.7 药敏试验按照王刚等[13]介绍的方法和 CLSI20013推荐的Kirby-Bauer方法进行药敏试验，分析分离株对15种抗菌药物的耐药性。

1.8 耐药基因PCR检测按照杨守深等[14]介绍的煮沸法分别提取分离株的DNA作为PCR模板。20.0 μL PCR反应体系：ddH2O 7.6 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix 10.0 μL，上、下游引物(25.0 μmol/L)各0.2 μL，DNA模板2.0 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃ 30 s、各引物退火温度退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察耐药基因检测结果。

2 结果

2.1 细菌分离10份直肠棉拭子样品分别划线接种哥伦比亚琼脂平板，培养过夜后，均长出大量灰白色圆形、凸起、边缘整齐、表面干燥的小菌落。挑取优势菌落进行纯培养，共分离到10株细菌，编号依次为YN21083～YN210812(即YN21083～YN210-89、YN210810～YN210812)，分离株在麦康凯琼脂上均不生长。分离株革兰染色均呈阳性多形杆菌，菌体一端膨大呈棒状，2个菌体常呈V字形排列，其中分离株YN21083的革兰染色形态见图1。

图1 分离株YN21083的革兰染色形态 (×1 000)

2.2 16S rDNA基因BLAST比对鉴定10株分离株PCR产物琼脂糖凝胶电泳均得到约为1 500 bp的条带，与预期相符，PCR产物鉴定正确。将YN21083～YN210812分离株测序得到的16S rDNA基因序列提交GenBank数据库，得到基因登录号依次为MZ841808～MZ841817。BLAST比对结果显示：10株分离株与C.amycolatum德国分离株FDAARGOS_991的同源性最高，其同源性在99.3%～100.0%之间，将10株分离株初步鉴定为C.amycolatum。

2.3 16S rDNA基因遗传进化分析MegAlign同源性比对结果显示，10株分离株与10株C.amycolatum参考株之间的同源性为97.2%～100.0%，与C.amycolatum模式菌株ATCC 49368T之间的同源性为98.3%～99.2%，10株分离株之间的同源性为99.0%～100.0%。系统进化树显示，10株分离株与10株C.amycolatum参考株形成同一个进化分支，4株乳酸棒状杆菌(C.lactis)形成另一个进化分支(图2)，进一步将10株分离株鉴定为C.amycolatum。

图2 分离株16S rDNA基因进化分析

2.4 药敏试验药敏试验结果显示，10株分离株均对卡那霉素和磺胺甲恶唑耐药；对庆大霉素和氯霉素中度耐药；对青霉素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩、头孢呋辛、阿米卡星和氟苯尼考敏感，可作为治疗的首选药物。4株分离株(YN21087、YN21088、YN21089和YN210810)对链霉素耐药；2株分离株(YN21085和YN21086)对诺氟沙星耐药；9株分离株(YN21086除外)对红霉素耐药。

2.5 耐药基因PCR检测23种耐药基因检测结果显示，10株分离株共检测到8种耐药基因aadA1、aadA2、tetA、tetM、qnrS、Sul1、Sul2和Sul3，其检出率分别为30.0%，30.0%，100.0%，60.0%，60.0%，100.0%，10.0%，20.0%(表1)；均未检测到blaTEM、blaCTXM、blaCIT、blaEBC、aacA4、tetB、tetG、tetL、ermA、ermB、ermC、qnrB、qnrC、qnrD和floR耐药基因。

表1 分离株耐药基因检测结果

3 讨论

C.amycolatum是近年来才被认识到的一种重要的条件致病菌，常引起人的乳房炎、阴道炎、腹膜炎、角膜溃疡、耳炎等多种疾病。动物C.amycolatum感染的报道十分少见，目前仅见猪(尿道感染)、犬(耳炎)和奶牛(乳房炎)感染的报道[9-10,15]，未见其他动物C.amycolatum感染的报道。本研究分别从弥勒县某规模化羊场3个圈舍的10只腹泻山羊直肠棉拭子样品各分离到1株C.amycolatum，共分离到10株C.amycolatum，首次证实了羊C.amycolatum感染的存在，并研究分离株的遗传进化、耐药性和耐药基因特征，为羊C.amycolatum感染的实验室诊断、预防和控制具有重要意义。

国内外C.amycolatum耐药性研究中，青霉素和红霉素是研究最多的2种抗菌药物。本研究中的10株分离株均为多重耐药菌株，其耐药种数为3～5种。其中，青霉素耐药率为0%，与CHEN等[3]报道的中国人源分离株耐药率一致，而与DRAGOMIRESCU等[16]报道的罗马尼亚分离株(7株)耐药率100.0%，ZALAS等[17]报道的波兰分离株(70株)耐药率71.4%和RIEGEL等[18]报道的法国分离株(54株)耐药率56.0%均存在很大的差异。10株分离株红霉素耐药率为90.0%，显著高于YAGUE等[19]报道的西班牙分离株(57株)耐药率52.3%和BALCI等[20]报道的土耳其分离株(4株)耐药率75.0%。10株分离株磺胺甲恶唑耐药率为100.0%，与CHEN等[3]报道的中国人源分离株耐药率一致，而远远高于NEEMUCHWALA等[20]报道的加拿大分离株(190株)耐药率33.2%。耐药性研究表明，中国分离株耐药性与国外分离株存在很大差异，可能与不同国家抗菌药物应用频率有关。青霉素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩、头孢呋辛和阿米卡星可作为我国治疗C.amycolatum感染的首选药物。

国内外C.amycolatum耐药基因检测的研究报道很少，仅见喹诺酮类耐药基因gryA[21]和红霉素类耐药基因ermB和ermX[22]的检测报道。本研究对10株分离株β-内酰胺类(blaTEM、blaCTXM、blaCIT和blaEBC)、氨基糖苷类(aadA1、aadA2和aacA4)、四环素类(tetA、tetB、tetG、tetL和tetM)、大环内酯类(ermA、ermB和ermC)、喹诺酮类(qnrB、qnrC、qnrD和qnrS)、磺胺类(Sul1、Sul2和Sul3)和氯霉素类(floR)共23种耐药基因进行检测，共检出8种耐药基因(表1)。10株分离株ermA、ermB和ermC耐药基因检出率为0%，其中ermB检出率与ORTIZ-PÉREZ等[22]报道的西班牙分离株(66株)检出率一致，而本研究中的10株分离株红霉素耐药率高达90.0%，因此红霉素耐药性与ermA、ermB和ermC耐药基因无相关性。10株分离株sul1耐药基因检出率为100.0%，并且磺胺甲恶唑耐药率也为100.0%，因此磺胺甲恶唑耐药性与sul1耐药基因具有很好的相关性。10株分离株aadA1和aadA2检出率仅为30.0%，而卡那霉素耐药率高达100.0%，因此卡那霉素耐药性与aadA1和aadA2无相关性。仅3株分离株YN21087、YN21088和YN21089检出aadA2，并且只有这3株分离株对链霉素耐药，因此链霉素耐药性与aadA2耐药基因具有很好的相关性。10株分离株tetA和tetM检出率分别高达100.0%和60.0%，而四环素耐药率为0%，因此四环素耐药性与tetA和tetM无相关性。

目前，国内外均无从人和动物腹泻病例样品中分离到C.amycolatum的研究报道，本研究从弥勒县某规模化羊场3个圈舍的10只腹泻山羊的直肠棉拭子样品中各分离到1株C.amycolatum，共分离到10株C.amycolatum。而同圈舍的10只健康山羊直肠棉拭子均未分离到C.amycolatum，因此，推测C.amycolatum是引起山羊腹泻的一种重要病原，应引起重视，其致病性和致病机制有待下一步深入研究。