硒化修饰对白术多糖抗氧化和免疫调节作用的影响

张 阳,梅 翠，李 会，熊 静，王士源，程 鹏，喻 祥，何玉张，吴俊伟，陈红伟,3* (.西南大学 动物医学院，重庆 402460;2.西南大学 医学研究院免疫学研究中心，重庆 402460;3.国家生猪技术创新中心，重庆 402460)

白术多糖(Atractylodesmacrocephalapolysaccharide，AMP)是白术的主要药用成分，具有多种生物活性，如增加小鼠的细胞和体液免疫应答[1]，缓解免疫抑制[2]，改善肠道菌群紊乱等[3]。另外，因其具有改善动物肠道健康和提高免疫功能的作用，有开发为高效饲料添加剂的前景[4]。但是，由于天然多糖的免疫活性往往较低，可通过对多糖进行结构修饰，增强其免疫活性，其中硒化修饰为常见的修饰方法[5]。由于硒和天然多糖的协同作用，其活性往往显著高于硒或多糖[6]。值得注意的是，XU等[7]报道了在热应激条件下，硒和AMP在调节鸡免疫功能中具有重要作用，并存在协同效应，但该研究仅将硒与AMP联合使用，未对AMP进行硒化修饰。本研究采用HNO3-Na2SeO3法合成了硒化白术多糖(sAMP)，并以未修饰的AMP和亚硒酸钠为对照，以环磷酰胺致免疫功能低下的小鼠为研究对象，考察了sAMP的抗氧化和免疫调节作用。在当前全面禁用饲用抗生素的背景下，本研究旨在对植物饲料资源的合理开发利用并为开发新型高效饲料添加剂奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂白术，重庆市荣昌区中医院；SOD和MDA试剂盒，南京建成生物有限公司；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司；印度墨汁，南京都莱生物技术有限公司；IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α ELISA试剂盒，武汉博士德生物有限公司；胰蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；小牛血清，兰州民海生物科技有限公司；小鼠淋巴细胞分离液，天津市灏洋生物制品科技有限公司；MTT，上海生工生物工程有限公司；RPMI-1640培养液，美国Giboc公司；ConA液，上海源叶生物科技有限公司等。

1.2 主要仪器与设备DC-NSG-10多功能提取浓缩机组，上海达程实验设备有限公司；YU-1950双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Nicolet iS50傅立叶变换红外(FT-IR)光谱仪，赛默飞世尔科技公司；Bio-Rad680伯乐酶标仪，美国伯乐生命医学产品(上海)有限公司等。

1.3 实验动物体质量相近、健康的断奶昆明种小鼠，购自重庆医科大学实验动物中心，参考本课题组报道的方法进行实验动物的饲养管理[8]。

1.4 sAMP的制备与表征[9]以本课题组已制备保存的AMP为原料，AMP提取纯化简要流程如下[10]：将薄层色谱法鉴定合格的白术饮片采用水提醇沉淀法制备白术粗多糖，采用三氯乙酸进行纯化和柱层析洗脱，收集多糖溶液，冷冻干燥得到AMP，采用色谱法鉴别AMP，硫酸-苯酚法检测AMP含量后保存备用。参考文献[9]，将1.0 g AMP粉置于三口烧瓶中，加入体积分数为0.4% HNO3水溶液100 mL，加热、搅拌使多糖全部溶解，水浴升温至70℃时，分别加入0.8 g Na2SeO3和1.44 g BaCl2，反应10 h。反应结束后，反应液冷却到室温，用无水Na2CO3调反应液pH至5～6，再加入适量无水Na2SO4沉淀未反应完的BaCl2，离心去沉淀，透析，取透析液少量加入抗坏血酸检测，无红色时停止透析，冷冻干燥得sAMP。具体反应条件通过正交试验设计进行优化。再分别取AMP和sAMP少量，采用溴化钾压片后进行红外光谱扫描表征。

1.5 动物试验设计

1.5.1抗氧化作用观察 将60只小鼠随机分为5个组，即空白组(NS)、环磷酰胺组(CP)、亚硒酸钠组(SS)、AMP组和sAMP组，每组12只，连续灌胃给药14 d，在灌胃第2 天除NS组注射生理盐水，其他各组小鼠均腹腔注射环磷酰胺(50 mg/kg)，连续注射5 d。正常对照组及环磷酰胺组给予等体积生理盐水，所有试验组均灌胃给药0.1 mg/kg，连续灌胃14 d，第14天给药后12 h，摘眼球采血，离心备用。取血完毕后，脱颈椎处死小鼠，迅速取肝脏，采用试剂盒检测小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力，比较各组的SOD活力大小；用试剂盒测定小鼠肝组织中丙二醛(MDA)的含量，检测各组对MDA含量的影响。

1.5.2免疫调节作用观察 将170只小鼠随机分为5组，分组和给药同1.5.1。对免疫器官胸腺和脾脏测质量，计算胸腺和脾脏指数；用碳粒廓清法比较各试验组对小鼠碳粒廓清功能的影响；用试剂盒测定小鼠血清中溶菌酶的含量。采用ELISA法测定血清中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量。采用MTT法测试小鼠脾淋巴细胞增殖活性。

1.6 主要测定项目与方法[8]

1.6.1SOD活力和MDA含量检测 将小鼠肝脏组织在4℃冰浴下用生理盐水制成10%组织匀浆，并严格按照试剂盒说明书方法，测定肝脏组织中SOD活力和MDA含量[11]。

1.6.2免疫器官指数的测定 取小鼠胸腺和脾脏，用滤纸吸干血迹后称其质量，以胸腺或脾脏质量与小鼠体质量的比值计算其器官指数(单位：mg/10 g)[8]。

1.6.3碳粒廓清指数和吞噬系数测定 按0.01 mL/g于小鼠尾静脉注入稀释的印度墨水。注入墨水后2和8 min用特制取血吸管从小鼠眼眶后静脉丛取血0.025 mL，立刻吹入0.1% Na2CO32.000 mL中，以0.025 mL正常小鼠血溶于2.000 mL 0.1% Na2CO3液校零，于分光光度计上675 nm处测定D值，计算碳粒廓清指数K和吞噬系数α，计算公式如下：碳粒廓清指数K=(lgD1-lgD2)/(t2-t1)；吞噬系数α=体质量×K1/3/(肝脏质量+脾脏质量)[12]。

1.6.4小鼠血清中细胞因子和溶菌酶含量的检测[8]按ELISA试剂盒说明书测定小鼠血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6以及溶菌酶的含量。

1.6.5淋巴细胞增殖试验(MTT法) 参考课题组已报道的方法[8]，简要流程如下：Hanks液反复冲洗脾脏，加入胰蛋白酶消化制成单个细胞悬液。取淋巴细胞分离液，加入脾脏细胞悬液，水平离心吸取中间白细胞层，加入1640培养液调整细胞浓度，接种入96孔板，每个样品重复8孔，同时加ConA液刺激，另设细胞调零孔。CO2培养箱中培养48 h后，加入20 μL MTT液，继续培养3 h后取出，吸出上清液，加入裂解液，检测570 nm下的吸光度，作为淋巴细胞增殖的指标。

2 结果

2.1 红外光谱检测结果AMP和sAMP在4 000.00～400.00 cm-1范围的红外吸收光谱如图1所示。与AMP光谱图(图1A)相比，sAMP光谱(图1B)显示出1个特征吸收带，其中2个出现在661.82，780.83 cm-1处，表明Se-O-C键的伸缩振动[13-15]，另1个出现在1 057.52 cm-1处，表明O-Se-O键的伸缩振动[13-16]。另外，文献报道亚硒酸钠的SeO32-在786.90，737.30 cm-1处有特征吸收峰[17]，sAMP在780.83 cm-1处有1个特征吸收峰，推断此峰为亚硒酸酯特征吸收峰，而sAMP经过透析后检测已无亚硒酸根，证明该特征峰是多糖与亚硒酸根形成的，多糖分子中存在亚硒酸基团。综上所述，表明AMP硒化修饰成功。

A. AMP的红外光谱图；B. sAMP的红外光谱图图1 红外吸收光谱图

2.2 抗氧化试验结果各组肝脏SOD活性和MDA含量如图2所示。sAMP组的SOD水平显著高于CP、NS和SS组(P<0.05)，SS和AMP组的SOD水平显著高于CP组(P<0.05)，sAMP组最高(图2A)。sAMP组的MDA水平显著低于其他4组(P<0.05)，而SS和AMP组的MDA水平显著低于CP组(P<0.05)(图2B)。

注：同一字母表示无显著性差异(P>0.05)，而不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。下同图2 对小鼠肝脏中SOD(A)和MDA(B)含量的影响

2.3 免疫器官指数、碳粒廓清指数和吞噬系数测定结果各组小鼠胸腺和脾脏指数、碳粒廓清指数和吞噬系数如图3所示。sAMP组的胸腺和脾脏指数以及碳粒廓清指数均显著高于CP和NS组(P<0.05)(图3A～C)，sAMP组的胸腺指数显著高于AMP和SS组(P<0.05)(图3A)，sAMP组的碳粒廓清指数显著高于SS组(P<0.05)(图3C)，sAMP组的吞噬系数显著高于CP组(P<0.05)(图3D)。

A.胸腺指数；B.脾脏指数；C.碳粒廓清指数；D.吞噬系数图3 对小鼠免疫器官指数、碳粒廓清指数和吞噬系数的影响

2.4 小鼠血清中细胞因子和溶菌酶含量测定结果各组小鼠血清中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α和溶菌酶水平见图4。sAMP组血清中IL-4水平最低，且显著低于NS组(P<0.05)(图4A)。sAMP组血清IL-6水平高于CP、NS和AMP组，但差异不显著(P>0.05)，SS和CP组之间存在显著性差异(P<0.05)(图4B)。sAMP组血清IFN-γ水平最高，且显著高于其余4个组(P<0.05)，CP组的IFN-γ水平最低，显著低于NS、AMP和sAMP组(P<0.05)(图4C)。sAMP组血清TNF-α水平最低，显著低于NS组(P<0.05)(图4D)。sAMP组的血清溶菌酶水平最高，显著高于其余4个组(P<0.05)，CP组的血清溶菌酶水平最低，显著低于其余4个组(P<0.05)(图4E)。然而，AMP和NS组之间的IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α和溶菌酶水平均没有呈现显著性差异(P>0.05)(图4)。

A.IL-4；B.IL-6；C.IFN-γ；D.TNF-α；E.溶菌酶图4 对小鼠血清中细胞因子和溶菌酶的影响

2.5 小鼠脾淋巴细胞增殖的测定结果通过ELISA测量570 nm处的吸光度作为淋巴细胞增殖的指标。如图5所示，sAMP组的D值显著高于NS和CP组(P<0.05)，但其他组间差异不显著(P>0.05)(图5)。

图5 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

3 讨论

HNO3-Na2SeO3法具有工艺简单、修饰产物硒含量高、污染少、生物利用度高、可行性强等诸多优点，是目前多糖硒化改性最常用的方法之一[18]。通常，硒化多糖的硒含量(102～104μg/g)远高于天然含硒多糖(<50 μg/g)[19]。本研究中，HNO3-Na2SeO3法的最佳反应条件为硝酸0.4%，反应时间10 h，反应温度70℃。在此条件下，sAMP的硒含量为(7.12±0.25) mg/g。随后，本课题组评估了硒化AMP的抗氧化和免疫调节作用。

SOD是体内清除自由基的重要抗氧化酶，对机体的促氧化和抗氧化系统起到平衡作用，可保护细胞免受损伤，通常血清中SOD含量代表细胞的抗氧化能力[16]。MDA是脂质过氧化的代谢产物，MDA水平升高反映脂质过氧化增强和组织损伤[20]。SHULEI等[21]报道了硒化枸杞多糖能显著提高14日龄鸡的血清SOD活性和降低MDA含量，且效果明显优于未修饰枸杞多糖。YUE等[16]采用HNO3-Na2SeO3法硒化修饰了五味子多糖，修饰产物也能显著提高14日龄鸡的血清SOD活性和降低MDA含量，且效果明显优于未修饰多糖。本研究结果显示，sAMP能显著提高环磷酰胺致免疫低下小鼠血清中SOD活性和降低MDA含量，且效果优于未修饰的AMP和亚硒酸钠，表明sAMP比AMP和无机硒具有更好的抗氧化活性。宿主免疫反应包括先天性和适应性免疫系统，并依赖于重要的免疫器官，如胸腺、脾脏等，环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型可用于评估多糖的免疫调节活性[22]。WENNA等[22]报道了白藜芦醇粗多糖可缓解环磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫器官萎缩和体质量减轻，并增加脾脏和胸腺的指数，对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠具有免疫增强作用。另外，红枣多糖、太子参多糖及其硒化产物、黄芪多糖和淫羊藿多糖等均可显著增加小鼠免疫器官指数[5,23-24]。本研究结果显示，sAMP组的胸腺、脾脏指数和碳粒廓清指数均显著高于NS和CP组，表明sAMP可促进和恢复小鼠免疫器官胸腺和脾脏的生长发育，提高小鼠的免疫清除功能。

溶菌酶是裂解革兰阳性菌的常用酶，主要由单核巨噬细胞释放，可以作为吞噬系统功能的指标，主要参与非特异性免疫反应[25]。而细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，分为Th1和Th2细胞，是机体免疫反应的一项主要指标[8]。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等细胞因子促进细胞免疫应答，而Th2细胞通常分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子来调节体液免疫[26-27]。近年来，有大量文献报道多糖对实验动物细胞因子水平或溶菌酶的影响，如黄芪和淫羊藿多糖硫酸酯混合物可明显提高小鼠血清中的溶菌酶含量[24]；红枣多糖可增强小鼠肠道溶菌酶和酸性磷酸酯酶的活性，下调肠道IL-1β等蛋白表达[23]；太子参多糖和硒化修饰产物均可以增加免疫抑制小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌[5]；白藜芦醇粗多糖可刺激免疫抑制小鼠血清和脾脏中TNF-α、IL-2和IFN-γ的产生[22]；枸杞多糖有效促进免疫抑制小鼠细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的分泌[28]；党参多糖可降低结肠组织中IL-6、TNF-α水平，提高结肠组织中IL-10水平[29]；黑木耳胞外多糖可提升血清中细胞因子IL-10的含量，对TNF-α和IL-6的水平无显著性影响[30]。正常情况下，Th1和Th2细胞亚群借助其分泌的细胞因子形成负反馈，相互制约，维持机体免疫系统的平衡[8]。在本研究中，sAMP显著增加了免疫抑制小鼠血清中溶菌酶和IFN-γ的水平，降低了IL-4和TNF-α水平，且效果优于未修饰的AMP。初步表明，sAMP可诱导机体产生γ干扰素，同时通过调节Th1/Th2处于一个相对平衡的状态，缓解环磷酰胺所致免疫功能低下水平。

淋巴细胞增殖能力的强弱，通常代表了淋巴细胞功能的高低，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究的一种常用方法[8]。裴钰等[31]报道了瓦松粗多糖可提高B、T淋巴细胞增殖率；灵芝多糖可提高小鼠淋巴细胞增殖能力[32]；苦瓜多糖、白芷多糖可促进环磷酰胺所致免疫低下模型小鼠脾淋巴细胞的增殖[33-34]。本研究发现，sAMP组小鼠脾淋巴细胞增殖(D570 nm)显著高于NS和CP组，增殖效果优于未修饰的AMP。

综上所述，sAMP能显著提高小鼠血清中SOD活性和降低MDA含量，显示出比未修饰的AMP和无机硒具有更好的抗氧化活性。sAMP可促进和恢复环磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫器官胸腺和脾脏的生长发育，提高小鼠的免疫清除功能，可诱导机体产生γ干扰素和溶菌酶，提高小鼠脾淋巴细胞增殖活性，缓解环磷酰胺所致免疫功能低下水平，总体效果优于未修饰的AMP。