基于量子点免疫层析的布鲁菌抗体诊断卡研制

祝令伟，纪 雪，陈 霞，陈 俊，卢葛锦，郭学军，孙 洋，郎需龙* (.中国农业科学院 长春兽医研究所，吉林 长春 30；.中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室，北京 006)

布鲁菌是一种胞内寄生革兰阴性球杆菌，该菌能引起人和动物的布鲁菌病(简称布病)，给流行地区和国家造成巨大经济损失并可严重影响人类健康，所以对布鲁菌病的准确鉴定是控制与根除布病的关键[1-2]。目前对于布病的血清学检测主要采用平板凝集试验、胶体金免疫层析、试管凝集试验、补体结合试验及酶联免疫吸附试验等[3]，而对现场检测来说，方便、耗时短、灵敏度高的检测产品已经成为今后研发趋势[4-5]。

量子点(quantum dot,QD)已经成为一种新型的检测指示剂[6]，其具有荧光强度高、发射波长可调等优点，通过对表面的官能团进行不同的修饰后，可和生物大分子进行偶联作为一种新型指示剂，其光稳定好、抗漂白能力强，对不同的抗原或抗体进行标记，通过免疫层析等方法进行结合，并利用一定波长激光激发呈现特定颜色反应，从而可快速检测样本中微量抗原或抗体[7-8]。

本研究通过将量子点作为新型荧光标记制备量子点免疫层析试纸条，可用于检测动物血清中是否含布鲁菌抗体，为相关疫病监测产品的研发提供更好的选择。

1 材料与方法

1.1 试剂、耗材与设备布鲁菌阳性血清、布鲁菌阴性血清购自中国兽医药品监察所；布鲁菌LPS(杭州贤至生物科技有限公司)；独立二抗抗原及独立二抗抗体购自洛阳佰奥通实验材料中心；羧基量子点微球北京纳诺金生物科技有限公司(量子点荧光微球的激发波长为365 nm，发射波长610 nm)；ELISA布鲁菌抗体检测试剂盒为青岛立见生物公司；大肠杆菌O157:H7阳性血清、沙门菌阳性血清、牛结核病阳性血清本实验室保存；小肠结肠耶尔森菌O9阳性血清为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存。

PVC底板购自东莞市金耒力生物技术有限公司；Sartorius NC膜(德国赛多利斯)；8964玻纤(上海杰一生物技术有限公司)；8975玻纤(怀远县通成纸制品有限公司)；吸水纸(怀远县通成纸制品有限公司)。

喷金划膜仪HM3035(上海金标生物科技公司)；微电脑自动斩切机ZQ2002(上海金标生物科技公司)；BIORAD凝胶成像设备(Universal Hood Ⅱ)。

1.2 量子点偶连及包被向0.1 mL量子点中加入0.3 mL MES缓冲液，经10 μL 10 g/L EDC-HCl和10 μL 10 g/L NHS快速混匀后，37℃ 15 min进行活化，8 000×g离心 20 min，弃上清，用10 mmol/L pH6.0 MES 缓冲液重悬至 0.2 mL，超声辅助混匀。加入待标记抗原或抗体，迅速混匀，37℃反应1 h，超声辅助混匀，加入封闭剂封闭后复溶。

1.3 试纸条制作将结合垫裁切成10 mm×300 mm 长条，划膜喷金仪将标记复溶的量子点标记物(LPS标记物和独立二抗抗体标记物以2∶1混合)喷涂到结合垫上，喷涂量为3 μL/cm。在25 mm 宽度赛多利斯CN140膜上划出检测线(T)和质控线(C)，T线同样采用LPS，C线用量子点标记独立二抗抗原，37℃鼓风干燥箱过夜烘干。

1.4 试纸条组装上海金标HM3035喷金划膜仪喷涂量子点微球和各检测带，上海金标ZQ2002微电脑自动斩切机切条，各种喷涂后的耗材分别裁切为需要规格。按顺序组装，装入定制卡壳和密封铝箔袋保存或用于检测。铝箔袋中装入干燥剂以保持试纸条性质稳定。使用BIORAD凝胶成像设备Universal Hood Ⅱ对检测卡内的试纸条进行荧光成像质检。

1.5 试纸条使用方法制定优化检测试纸条使用方法，分别采用磷酸盐缓冲液、生理盐水、蒸馏水等作为上样缓冲液进行检测，根据不同上样量制定量子点免疫层析试纸条使用条件，并制定检测说明书。

1.6 试纸条特异性测试分别检测羊布鲁菌病阳性血清、结核菌阳性血清、大肠杆菌O157:H7阳性血清、小肠结肠炎耶尔森菌O9阳性血清、沙门菌阳性血清、猪链球菌2型阳性血清各1份，血清样本采用缓冲液10×稀释点样，层析10 min后读取检测结果。

1.7 试纸条敏感性测试将布鲁菌病阳性血清采用生理盐水进行倍比稀释，稀释倍数为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024，1∶2 048，并采用量子点荧光微球检测卡进行测试。

1.8 临床血清样本测试将量子点检测试纸条对临床血清样本进行测试，并分别使用试管凝集试验(SAT)、ELISA、市售布鲁菌抗体胶体金试纸条等方法进行比对试验。

2 结果

2.1 试纸条构建建立的量子点检测试纸条样品对布鲁菌阳性血清及阴性血清检测符合预期，且阳性血清样本T线显色强度高，使用BIORAD凝胶成像设备Universal Hood Ⅱ对检测卡内的试纸条进行荧光成像见图1。

图1 试纸条荧光成像图片

2.2 试纸条使用方法从包装铝箔袋中取出检测卡，将其置于平坦的台面，用滴管垂直滴加10～20 μL血清至加样孔，采用微型巴斯德吸管滴加约80 μL缓冲液，检测结果于10 min时读取。结果见图2，仅质控区(C)出现1条亮带，判定为阴性。在质控区(C)和检测区(T)均出现条带，判定为阳性。质控区(C)未出现条带，判定为无效。通过试验得知，生理盐水、PBS、蒸馏水等均可作为缓冲液进行样本检测。读取时可使用365 nm波长荧光手电进行激发检测或采用相关波长仪器读取检测结果。

图2 布鲁菌抗体检测试纸条(量子点法)检测结果判定示意图

2.3 量子点试纸条特异性测试使用试纸条分别检测结核菌阳性血清、大肠埃希菌O157:H7阳性血清、小肠结肠炎耶尔森菌O9阳性血清、沙门菌阳性血清、猪链球菌2型阳性血清等，未发生非特异性交叉反应(图3)。

1.布鲁菌阳性血清；2.布鲁菌阴性血清；3.结核菌阳性血清；4.大肠埃希菌O157:H7阳性血清；5.小肠结肠炎耶尔森菌O9阳性血清；6.沙门菌阳性血清；7.猪链球菌2型阳性血清图3 量子点检测试纸条血清特异性测试

2.4 试纸条敏感性测试针对布鲁菌病阳性血清进行倍比稀释后的样品进行检测，可检测到1∶512倍稀释后的样品，市售产品仅检测到1∶64倍稀释的血清稀释样品。本研究的量子点荧光检测试纸条敏感性测试见图4，从左至右1～11分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024，1∶2 048倍布鲁菌阳性稀释血清，1∶512倍稀释后仍可见到荧光检测条带。市售胶体金采用竞争法，出现条带为检测结果阴性。检测结果见图5，从左至右1～10分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024倍布鲁菌阳性稀释血清，可见1∶128倍稀释开始有弱的条带出现，即为阴性。

1～11.1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024，1∶2 048倍布鲁菌阳性稀释血清图4 量子点荧光检测试纸条敏感性测试

1～10.分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024倍布鲁菌阳性稀释血清图5 市售胶体金检测试纸条敏感性测试

2.5 试纸条临床样本检测将构建的检测试纸条对不同种类动物布鲁菌阳性血清进行鉴别诊断，本研究所采用的试纸条对临床样本检测和ELISA检测结果一致(表1)。

表1 试纸条临床样本检测结果 份

3 讨论

布鲁菌作为一种重要的人兽共患病，给养殖业和经济发展造成巨大的损失[9]。在进行养殖业防控策略中，进行大范围的检疫净化是一项重要的工作，及时、快速、准确的诊断是进行防控和消除布鲁菌病的重要措施，在临床检测中，血清学鉴定是一项简便、经济的做法[10]。

免疫层析技术是进行动物疫病监测中比较常用的快速检测方法，目前已有多种基于胶体金技术的免疫层析试纸条的研制，但由于胶体金颗粒没发光特性，仅依靠颜色进行结果判定时导致其灵敏度降低[10-11]。本研究采用量子点结合免疫层析检测技术，构建量子点免疫层析布鲁菌抗体检测试纸条，所使用量子点与传统染料相比，其激发波长较宽而发射波长较窄，发射荧光稳定，在抗荧光漂白方面具有极大优势。以往胶体金试纸条或类似量子点层析试纸条研制方法，采用表达蛋白的外膜蛋白[12]、葡萄球菌蛋白A(SPA)[13]等作为结合抗原进行布鲁菌病抗体的检测。本研究曾采用葡萄球菌蛋白A偶联量子点微球并喷涂于样品结合垫，对临床不同种属动物标本进行检测时，由于蛋白A对不同种属动物抗体结合能力具有一定差异，部分样本出现了假阴性结果。在对临床样本测试时，与市面上采购的同类型胶体金产品进行比对，其特异性优于胶体金检测试纸条。在研究过程中，参考类似病原体的抗体层析试纸条检测方法[14-15]，在样品结合垫及检测线均用布鲁菌LPS进行夹心法检测的情况下，对结合垫及检测线的抗原浓度比例进行调试，可达到最佳检测效果。另外，如在进行免疫层析产品研发中，出现由于抗体竞争等原因，控制线较弱或无法出现的情况，可采用独立二抗抗原及抗体作为控制线，从而解决测试纸条控制线条带显色微弱等各种问题[16]。

总体来说，采用量子点免疫层析检测技术对病原微生物所导致的疫病进行抗原或抗体检测研究中，经过条件优化，既可使用仪器读取，也可采用常规的荧光手电照射的方法，使临床应用更加准确方便。