一种基于凝胶过滤层析的水疱性口炎病毒(VSV)的纯化方法

孙 赫，岳玉环，赵永坤，吴广谋，田 园，张守峰，张国利*，李泽鸿 (1.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118；.中国农业科学院 长春兽医研究所，吉林 长春 1301)

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)作为21世纪最有应用前景的癌症治疗载体而备受关注。VSV可以引起马、牛和猪等的高度接触传染性水疱性疾病，属于定义明确的弹状病毒科；临床上受感染动物以口腔黏膜、牙垫、舌头、嘴唇、鼻孔、蹄子和乳头的典型水泡为主要特征，很容易和口蹄疫、猪水疱病、猪水疱疹等相混淆[1]。据查证，多种实验动物具有易感性，人只是偶尔感染，产生类似流感样症状；可以判断此病毒具有潜在的人畜共患性[2]，并可能在与病毒密切接触的人群中引起流感样疾病。

VSV主要有2种血清型，分别为水疱性口炎印第安纳病毒(vesicular stomatitis Indiana virus，VSV-IND)和水疱性口炎新泽西州病毒(vesicular stomatitis New Jersey virus，VSV-NJ)。不同血清型的VSV基因组长度略有差异，但基因组织和构成相似；长11.0～11.3 kb，具有最简单的基本结构，负链RNA从基因组的3′→5′端依次编码核蛋白(nucleoprotein，N)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)、糖蛋白(glycoprotein，G)、大转录酶蛋白(large transcriptase protein，L)5种蛋白[3]。N蛋白为病毒衣壳蛋白的主要成分，保护着病毒RNA免受各种核酸酶的消化，相对分子质量为47 kDa；P蛋白由222个氨基酸残基组成，相对分子质量为25 kDa；M蛋白是一种连接蛋白，能够使核衣壳与嵌有糖蛋白的脂质膜相连，相对分子质量为26 kDa；G蛋白是病毒的主要表面抗原，相对分子质量为57 kDa；L蛋白决定着病毒RNA的转录活性，相对分子质量为241 kDa[4]。基因组上的基因转录以递减的产量进行，原因是由于3′启动子的转录活性在每个基因连接处减弱，病毒基因组的3′端基因转录更加丰富，近于5′端少量转录。

在过去的几十年里，慢病毒基因疗法在研究和临床上的出现和成功，而成为人们关注的焦点[5]。VSV糖蛋白微型载体，在基因治疗和基因编辑应用方面具有未开发的潜力[6]。此外，由于其多功能性，VSV模型已广泛应用于癌症、肿瘤治疗，作为一种有效的溶瘤病毒[7]、疫苗载体和研究异源病毒包膜蛋白的基因传递工具。要最大限度地发挥这类媒介的潜力，病毒的纯化是必不可少的。现有的病毒纯化方法主要分为2种，分别是密度梯度离心法和层析法[8]。层析法相比较密度梯度离心法而言，更具专业性和规范性，适用于生产质量管理规范(good manufacturing practices，GMP)和批量生产。本研究通过凝胶过滤层析法对收获的病毒液上清进行2轮的蛋白纯化，经鉴定后，最终得到纯度较高的VSV纯品。

1 材料与方法

1.1 材料DMEM高糖培养基(美国Gibico公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；T25、T75培养瓶、培养皿(美国Corning公司)；BHK细胞系(中国农业科学院长春兽医研究所夏咸柱院士赠予)；1.5 mL 无酶离心管(美国Axygen公司)；VSV毒株(中国农业科学院长春兽医研究所生物技术应用与基因工程药物实验室保存)；Millex-GP针头式0.22 μm滤膜(美国Millipore公司)；PBS缓冲液(武汉莫纳生物有限公司)；硫酸铵颗粒、HRP抗体稀释液、牛血清白蛋白(北京索莱宝股份有限公司)；10 000 kDa超滤离心管(美国Merck公司)；VSV-G-Tag抗体、羊抗兔IgG-HRP(武汉博士德生物有限公司)；ProteinA-HRP(美国Abcam公司)；Focurose 6FF(武汉汇研生物有限公司)；一步式RT-PCR试剂盒、病毒RNA提取试剂盒(日本TaRaKa公司)。

1.2 VSV的制备从液氮中取出冻存的BHK细胞，于37℃水浴快速融化，300×g离心3 min后接种T75培养瓶中；每个T75培养瓶的BHK细胞密度约为6×106cell/mL，每瓶加入15 mL新鲜配置的含10%胎牛血清的DMEM(1%青霉素和链霉素)，待细胞融合度达70%～80%时，开始加入VSV毒株感染细胞；与此同时，培养瓶中的培养基也相应换成1%胎牛血清的DMEM(1%青霉素和链霉素)。

1.3 病毒液的收集及预处理密切观察细胞的生长状态，当细胞开始出现CPE反应后，相隔2 h观察1次；如出现60%～70% CPE反应后，细胞刮片刮离细胞，移液器反复吹洗瓶壁上的细胞数次，使病毒粒子完全从细胞中释放出来。将收集的病毒液在-80℃和0℃之间反复冻融3～5次，12 000×g离心15 min后弃去沉淀，取上清置于-80℃保存。

1.4 VSV的纯化缓冲液的配置：将PBS(0.1 mol/L)速溶试剂置于1 L超纯水中，调pH 7.2；取4 g NaOH固体加入1 L超纯水，配置NaOH(0.1 mol/L)溶液。通过Waters高压液相纯化系统(美国Waters公司)按照以下步骤，即可得到高纯度的VSV。

第1轮纯化：取融化后的病毒液上清100 mL，根据饱和硫酸铵计算表，取26 g硫酸铵加入病毒液中，玻璃棒搅拌均匀，形成42.35%饱和硫酸铵溶液，4℃静置30 min。12 000×g离心15 min后弃上清，将沉淀全部溶解在2 mL PBS中，0.22 μm滤膜过滤后备用。

第2轮纯化：用500 mL PBS平衡Focurose 6FF柱，流速为1 mL/s。柱床平衡后，设置吸光度为280 nm，检测器调零。将第1轮纯化的病毒液上样，密切关注吸收峰值图。选取各个吸收峰收集，目标吸收峰为第1次出现的吸收峰，取第1吸收峰的样品用10 kDa的超滤离心管进行浓缩。当所有吸收峰最后归于平衡后，使用0.1 mol/L NaOH清洗柱床，水洗后1‰叠氮钠封柱。通过SDS-PAGE对收集的纯化样品进行分析，依据条带位置判断纯化样品的准确性。

1.5 ELISA、Western blot分析病毒的免疫原性ELISA：取纯化VSV样品用碳酸盐缓冲液10倍稀释包被于酶标板中，每孔100 μL，37℃静置1 h；5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，加入稀释1 000倍的VSV-G-Tag抗体孵育1 h；PBST洗涤后，二抗为2 000倍稀释的ProteinA-HRP孵育1 h；洗涤后TMB显色15 min，每孔50 μL终止液终止反应，酶标仪D450 nm检测数值。

Western blot：取纯化VSV样品进行SDS-PAGE，切胶后转硝化纤维素薄膜，15 V 1 h，用含5% BSA的TBS室温封闭2 h，TBST洗涤3次，每次10 min；加入1 000倍稀释的VSV-G-Tag抗体室温孵育2 h；TBST洗涤后，加入2 000倍稀释的羊抗兔IgG-HRP孵育2 h，洗涤后ECL法上机(Tanon5200，上海天能科技有限公司)检测。

1.6 RT-PCR鉴定病毒的血清型据NCBI库中已知的VSV-IND-P和VSV-NJ-L基因序列设计特异性引物[9]，分别为VSV-IND-P：F-5′-GCAGATGATTCTGACAC-3′，R-5′-GACTCTCGCCTGATTGTA-3′；VSV-NJ-L：F-5′-TTGGTTCGGAACTTGGATTC-3′，R-5′-ACTCATGCGGTATTTACCCTTG-3′。根据说明，使用病毒总RNA提取试剂盒从纯化病毒液中提取RNA。采用一步式RT-PCR试剂盒扩增相应的蛋白基因片段，反应体系在50 μL溶液中进行：Enzyme Mix 2 μL、Buffer 25 μL、VSV-IND-P/VSV-NJ-L正、反向引物各2 μL、RNA 1 μL、dH2O 20 μL。反应条件：50℃ 30 min、95℃ 15 min预变性；94℃ 1 min 变性，50℃ 1 min退火，72℃ 3 min延伸，反应40个循环；72℃延伸10 min、4℃孵育10 min，2%琼脂糖凝胶电泳分析试验结果。

1.7 Reed-Muench法计算病毒的TCID50将纯化的VSV用1%DMEM在灭菌试管内作连续的10倍稀释，分别取0.1 mL加入已经长成单层的Wish细胞96孔培养板中。每个稀释度的病毒液接种8个复孔，37℃、5%CO2连续培养，逐日观察，直至终点。统计后按照公式计算：(高于50%病毒感染的百分率-50%)/(高于50%病毒感染的百分率-低于50%病毒感染的百分率)；上式获得的结果加上高于50%病毒感染或死亡稀释度的对数，即0.1 mL VSV病毒液的TCID50。

1.8 VSV成品的电镜分析将VSV病毒悬液滴在封口膜上，使用支持膜的载网倒扣在悬液上静置2 min。夹起载网，用滤纸从载网边缘吸去多余液体，立即将载网倒扣在负染液滴上2%磷钨酸水溶液(PTA)(pH6.8)，静置1～2 min。夹起载网，用滤纸吸去多余染液，置透射电子显微镜检测。

2 结果

2.1 VSV的纯化结果由于细胞上清VSV病毒液中含有部分牛血清成分，极难通过密度梯度离心完全去除。为此探索了其他纯化路径，经过不同浓度的饱和硫酸铵试验，最终发现42.35%的饱和硫酸铵可以沉降极大部分病毒颗粒和很少部分的其他杂质成分，如此便成功进行了第1轮高盐除杂，达到了初步纯化的目的。在第2轮凝胶过滤层析结果中，分析吸收峰曲线(图1)和SDS-PAGE(图2)。吸收峰曲线中可以看到病毒粒子的特征吸收峰高度达到了0.90，相比而言，杂蛋白的吸收峰峰值仅有0.13，说明了第1轮凝胶过滤层析中已经完整的把大部分VSV纯化出来。同时也在SDS-PAGE结果图中印证了这一结果，在泳道1中蛋白成分特别复杂，说明仍有一部分培养基成分；而在泳道2～4中，条带单一，目的蛋白相对分子质量为47 kDa，与VSV的N蛋白大小一致，其余病毒蛋白由于表达量的原因未显影。经过2轮纯化，成功纯化出含量较多纯度尚可的VSV粒子。

图1 VSV纯化曲线图

M.蛋白Marker；1.42.35%饱和硫酸铵沉淀结果；2～4.VSV纯化吸收峰的特征峰型；5.杂蛋白吸收峰的峰尖样品图2 纯化VSV的SDS-PAGE检测结果

M.蛋白 Marker；1.纯化样品图3 纯化样品Western blot检测结果

2.3 VSV血清型的鉴定RT-PCR 扩增病毒蛋白基因，分析2%琼脂糖凝胶电泳图，在泳道2～4可以看到614 bp的明显条带(图4)，泳道5～7没有观察到明显条带，说明此毒株为VSV-IND血清型。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～4.VSV-IND-P样品；5～7.VSV-NJ-L样品图4 纯化样品RT-PCR检测结果

2.4 VSV的滴度测定根据Reed-Muench法计算培养3 d后病毒的TCID50(表1)，(92.3%-50.0%)/(92.3%-33.3%)+2≈2.72，因此该病毒的TCID50是0.1 mL 10-2.72稀释的病毒液，查反对数得524，即该病毒524倍的稀释液0.1 mL 等同于1个TCID50。

表1 TCID50的测定结果

2.5 VSV的电镜观察分析电镜结果(图5)，该病毒颗粒大小为(45～70) nm×(100～200) nm，在电镜下呈子弹状或锥体状，未经固定的样品呈多边形，符合弹状病毒的基本特征。

综上试验结果可以看出，通过2轮纯化步骤成功地获得了VSV，成功达到了预期结果，最终纯化样品滴度合格、纯度可观，且仍具有VSV的活性和免疫原性。

3 讨论

VSV作为弹状病毒的基本模型，在越来越多的领域发现了其强大用途[11]。在疫苗研究方面，基于VSV改良的重组病毒疫苗载体防制传染病方面取得了相当大的进展。由于VSV具有遗传稳定性、低毒性、高滴度性的特点，重组VSV疫苗平台相当火热，例如Erbevo品牌出售的rVSV-ZEBOV疫苗于2019年获准在美国和欧盟使用[12]。在癌症治疗方面，VSV成为溶瘤载体的主要候选物[13]，其肿瘤选择性和溶解潜力已被证明可用于多种癌症类型，包括宫颈癌和乳腺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤等[14-16]。

作为如此强大的基因治疗模型，少不了高纯度的病毒纯化步骤。在本研究中，通过对不同饱硫酸铵浓度的探究，最终锁定42.35%的饱和硫酸铵浓度，可以达到既满足大量VSV沉降的目的，又满足少量杂蛋白存在的情况。所以增设了第1轮饱和硫酸铵沉淀高盐除杂的步骤，但仍有不足，根据试验SDS-PAGE结果，还可以更加细化饱和硫酸铵浓度以及增加其他蛋白纯化步骤。在病毒原液上清中，发现了病毒粒子的大小远远大于其他杂蛋白的大小，所以选用了凝胶过滤层析的方法[17]，由于分子筛的效应，大分子物质由于通过路程较短会率先通过层析柱，而相对分子质量较小的物质会进入层析柱材料内部，通过的路程将远远超过大分子蛋白，据此从而达到分离目的蛋白的目的[18]；由于柱料是高度交联6%的琼脂糖，同时也起到了保护目的蛋白的作用。从VSV纯化曲线峰图结果来看，正好印证这一原理。分析2轮的纯化步骤，发现如不通过饱和硫酸铵沉淀，直接进行凝胶过滤层析，会大大影响目的病毒粒子的纯化效率和纯度。通过简单的处理，分2步进行纯化，非常有利于高纯度病毒粒子的制备。综上，本研究通过借鉴和摸索，成功开创出一套简易实用的VSV纯化方案，整个过程用时较短、省钱省工，普通实验室当日即可完成。同时，凝胶过滤层析很容易符合GMP药物生产规范，为VSV基因药物模型的研究和改造奠定了有力的基础。