脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA的表达水平及其与预后的相关性

张跃欣，苏博，赵墨，魏康康，周国平

南阳市中心医院神经外科1、病理科2，河南 南阳 473000

脑胶质瘤是起源于颅内神经系统的恶性肿瘤，发生率高达50%左右，位居颅内恶性肿瘤的首位[1]。胶质瘤具有生长迅速、易侵袭转移且术后复发率较高等特点[2]。胶质瘤治疗手段较为局限，临床上常规采用手术联合放化疗治疗，但治疗效果较差，术后复发率约为25%[3]。因此，早期明确脑胶质瘤的发病机制和治疗靶点成为近年来的研究热点。叉头框C1(FOXC1)是叉头框(forkhead box，FOX)家族成员之一，FOXC1主要参与细胞的增殖、分化及凋亡等生理过程[4]，近年来发现FOXC1异常表达与多种恶性肿瘤诸如乳腺癌、胰腺癌及肺癌等发病机制密切相关[5]，然而，目前鉴于FOXC1在人脑胶质瘤组织中的表达水平尚不完全清楚，本研究通过采用生物信息学分析TCGA 数据库中脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA 的表达及其与预后的关系，并进一步采用独立样本进行FOXC1表达水平的验证，以期为脑胶质瘤的治疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据库来源 TCGA 数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/) 和TIMER 数 据 库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。

1.2 研究方法

1.2.1 FOXC1在脑胶质瘤组织中的表达 TCGA数据库中下载脑胶质瘤组织中的基因表达数据，其中包括701例脑胶质瘤组织及50例正常脑组织，样本中FOXC1 mRNA表达水平采用Log2进行转换。

1.2.2 临床预后分析 下载并分析TCGA 数据库中脑胶质瘤患者的预后资料，具体包括性别、年龄、组织学类型、WHO分型、IDH状态、1p/19q 共缺失等临床-病理资料。多因素COX回归分析脑胶质瘤患者预后的影响因素，采用K-M 曲线分析脑胶质瘤组织中FOXC1表达和总体生存率的关系。

1.2.3 HNSCC 免疫浸润细胞分析 脑胶质瘤组织中FOXC1 表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性采用TIMER数据库进行分析。

1.2.4 独立样本验证 获取2022 年1～6 月于我院就诊的20例脑胶质瘤和20 例脑外伤患者的石蜡切片，20 例脑胶质瘤患者男8 例，女12 例，平均年龄(54.12±6.12)岁；20例脑外伤患者男9例，女11例，平均年龄(55.23±7.66)岁，两组性别及年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究经过我院医学伦理委员会批准(YXLL2021-0045)。40 例标本进行脱蜡、水化等修复后浸入3%H2O2溶液，并在室温中孵育30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1 次，采用山羊血清(10%浓度)封闭30 min，PBS洗涤1次加入一抗后继续孵育6 h，PBS洗涤1次后再次加入二抗孵育2 h，最后采用苏木精染色及中性树胶封片。参考本课题组前期发表的文献[6-7]，脑胶质瘤组织中FOXC1 阳性表达水平采用细胞染色强度及染色率计算，细胞染色强度分为无着色(0 分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)和棕褐色(3分)，细胞染色率为0 (0 分)、0～25% (1 分)、26%～50% (2 分)、51%～75%(3 分)和76%～100%(4 分)。细胞染色强度得分×细胞染色率得分为脑胶质瘤组织中FOXC1表达水平，得分≤3分为FOXC1低度表达，3 分＜得分≤6分为FOXC1中度表达，6 分＜得分为FOXC1 高度表达。兔源性FOXC1 单克隆抗体、SP 免疫组化染色试剂盒及二抗(HRP 标记羊抗兔IgG)均购买于上海碧云天生物试剂有限公司(上海，中国)。

1.3 统计学方法 采用R 软件(4.2.2)分析资料。脑胶质瘤组织和正常组织中FOXC1 mRNA 表达数据不符合正态分布，两组间比较采用U检验，脑胶质瘤患者预后的危险因素采用COX 回归分析，FOXC1 mRNA 表达水平与患者生存率的关系采用K-M 曲线分析，Spearman 分析FOXC1 mRNA 表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXC1 在脑胶质瘤组织中的表达 701 例脑胶质瘤组织和50 例正常脑组织中FOXC1 mRNA表达水平分别为1.87(1.54，2.16)和1.61(1.14，1.92)，与正常脑组织比较，脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA表达水平显著升高，差异具有显著统计学意义(U=23.12，P＜0.01)。

2.2 FOXC1表达和脑胶质瘤患者预后的关系 经K-M 曲线分析结果显示，脑胶质瘤中FOXC1 高表达和低表达中位生存时间分别为933 d 和2 835 d，脑胶质瘤中FOXC1高表达生存率显著降低(HR=1.76，95%CI：1.25～2.49，P=0.001)，见图1。

图1 脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA表达和患者生存率关系的K-M曲线Figure 1 Association between FOXC1 mRNA expression and survival rate in glioma by K-M curves analysis

2.3 脑胶质患者预后的影响因素 经多因素COX 回归分析证实，年龄(＞40 周岁)、WHO 分级(G3)、IDH 状态(突变型)、1p/19q 共缺失(非共缺失)和FOXC1 表达(高表达)均是脑胶质瘤患者预后的独立影响因素(P＜0.05)，见表1。

表1 脑胶质瘤患者预后影响因素的多因素Cox回归分析Table 1 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in patients with glioma

2.4 脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA表达和免疫细胞浸润程度的相关性 经Spearman 相关性分析结果显示，脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA表达和中性粒细胞(r=0.433，P＜0.001)、巨噬细胞(r=0.400，P＜0.001)、嗜酸性细胞(r=0.365，P＜0.001)等细胞浸润程度呈显著正相关，与Tgd 细胞(r=-0.115，P＜0.05)、TFH 细胞(r=-0.158，P＜0.001)及pDC 细胞(r=-0.207，P＜0.001)浸润程度呈显著负相关，见图2。

图2 脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA 表达和免疫细胞浸润程度的相关性Figure 2 Correlation between FOXC1 mRNA expression and the degree of immune cell infiltration in glioma tissue

2.5 脑胶质瘤组织及正常组织中FOXC1 mRNA表达的免疫组化验证 进一步采用独立样本验证脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA 的表达水平，纳入20 例脑胶质瘤组织和20例健康脑外伤的脑组织，采用免疫组化探讨发现，20 例脑胶质瘤组织中FOXC1 高度阳性表达14 例，中度阳性表达6 例，正常脑组织中FOXC1均无表达，差异有显著统计学意义(χ2=15.000，P＜0.001)，见图3。

图3 胶质瘤组织中FOXC1高度阳性表达(比例尺=100 mm)Figure 3 FOXC1 was highly expressed in glioma tissue(scale=100 mm)

3 讨论

脑内胶质细胞异常增殖形成脑胶质瘤，星形细胞瘤是最为常见的病理类型之一，脑胶质瘤易浸润生长，边界不清，手术难以完全切除，且对放化疗不敏感，研究发现手术联合放化疗的患者术后1 年和2 年生存率约为78%和60%[8]，且病理分级越高，患者中位生存时间越短[9]。目前关于脑胶质瘤的具体发病机制尚不清楚，深入探讨脑胶质瘤的致病机制和治疗靶点对提升患者临床预后具有重要的价值。

FOXC1 近年来被证实与多种恶性肿瘤的发病机制密切相关，一项Meta 分析研究结果证实，在各种癌症中，FOXC1蛋白高表达与患者较差的生存结局显著相关，尤其是在乳腺癌患者中，且FOXC1 蛋白表达可作为多种癌症患者不良预后的生物学标志物[10]。罗倩等[11]采用免疫组化证实FOXC1 在胰腺癌组织中显著高表达，且FOXC1 高表达组中位生存时间显著低于FOXC1 低表达组。此外，李立明等[12]发现肺癌A549细胞株中FOXC1 蛋白及mRNA 水平显著上调，沉默FOXC1 后能显著降低A549 细胞株的增殖和侵袭能力。彭聪等[13]进一步发现干扰FOXC1 后能显著逆转非小细胞肺癌对化疗药物吉非替尼的耐药性。目前关于FOXC1 在人体脑胶质瘤组织中的表达水平的相关性研究较少，本研究通过采用生物信息学数据证实脑胶质瘤组织中FOXC1 mRNA 表达水平显著升高，FOXC1 高表达组生存率较低，且COX 多因素回归分析进一步证实FOXC1 表达(高表达)是脑胶质瘤患者预后的独立影响因素，因此，本研究结果均提示FOXC1 可作为脑胶质瘤患者预后的一项生物学标志物。李元元等[14]发现脑胶质瘤U251 细胞中FOXC1 mRNA 和蛋白表达水平均显著升高，且FOXC1 沉默后能显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖并促进其凋亡，在机制上可能与调控Notch通路有关，此外，在缺氧条件下，FOXC1 也受到缺氧诱导因子HIF 的调控，HIF-2a可上调FOXC1的表达而促进脑胶质瘤的局部侵袭[15]；另一方面，胶质母细胞瘤中FOXC1高表达与术后高复发率和脑胶质瘤对替莫唑胺耐药有关，当细胞中FOXC1 表达下调后可显著增加替莫唑胺诱导下的肿瘤细胞凋亡水平[16]。

肿瘤微环境异常在恶性肿瘤的发病机制中同样扮演了重要作用，免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分[17]。本研究发现脑胶质瘤组织中FOXC1 表达与中性粒细胞浸润程度呈现显著正相关性，外周血中性粒细胞数量可鉴别低级别和高级别脑胶质瘤，外周血中性粒细胞数量在高级别脑胶质瘤患者中相对较高[18]。活化的中性粒细胞释放的DNA 组蛋白和蛋白质组成的网状结构被称为中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)，NETs 可激活多种信号通路促进脑胶质瘤的发生发展[19]。Zha 等[20]发现，与低级别脑胶质瘤比较，高级别脑胶质瘤组织中中性粒细胞浸润和NETs形成较为显著，NETs过度产生可促进脑胶质瘤细胞的恶性生物学行为，NETs 可通过活化NF-κB 信号通路并促进胶质母细胞瘤中IL-8 的大量分泌，随后，IL-8可招募中性粒细胞并进一步促进脑胶质瘤的进展。除中性粒细胞外，本研究同样发现FOXC1与巨噬细胞浸润程度呈现显著正相关性，与Tgd 细胞、TFH 细胞(r=-0.158，P＜0.001)及pDC细胞呈现显著负相关性，提示在脑胶质瘤中，FOXC1可通过调节多种免疫细胞的浸润程度而参与脑胶质瘤的发生发展。为进一步验证FOXC1在脑胶质瘤中的表达，我们采用免疫组化法发现FOXC1 在脑胶质瘤组织中多数呈现高度阳性表达，而在正常脑组织均无表达，这结果也间接证实本研究中生物信息学的数据结果。

综上所述，脑胶质瘤中FOXC1 显著高表达，FOXC1 可作为影响脑胶质瘤患者预后的一项生物学标志物，然而，FOXC1 如何参与调控脑胶质瘤发生发展的具体机制仍是我们下一步研究的方向。