评价芝麻种质油分含量水平的SSR 标记筛选与分析

徐芳芳，郑 磊，琚 铭，马 琴，李 春，段迎辉，张仙美，苗红梅

（1.河南省农业科学院 芝麻研究中心，河南 郑州450002；2.河南省特色油料基因组学重点实验室，河南 郑州450002；3.漯河市农业科学院，河南 漯河462300）

芝麻（Sesamum indicumL.，2n=26）属胡麻科胡麻属，是世界上最古老的油料作物之一，也是我国重要的特色优质油料作物。芝麻籽粒含有丰富的脂肪（50%～60%）、蛋白质（18%～24%）、多糖、膳食纤维以及维生素和微量元素[1]。其中粗脂肪含量为50%～60%，主要由油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸组成，占油分总量的80%以上。因此，芝麻油被认为是最为理想的植物油脂[1-2]。此外，芝麻籽粒中还含有芝麻酚、芝麻素等抗氧化物质，广泛应用于食品、营养保健、制药及工业等各行业[1，3]。

芝麻属于高含油量作物。但是在现有芝麻种质资源中，籽粒油分含量和蛋白质含量的变化范围较大，分别为29.5%～62.7%和12.9%～31.0%[4-5]。研究表明，芝麻油分含量和蛋白质含量等品质性状属于数量性状，受多基因控制，遗传特性较为复杂[6-8]；同时，油分含量性状易受基因型+环境共同影响，对优质新品种选育有一定的影响[9-10]。在高油、高蛋白等优质芝麻种质鉴定及品种选育过程中，目前多采用传统的化学法、核磁共振法以及近红外光谱法进行表型测定，工作量大、耗时长[5，11-12]。发掘品质相关分子标记和基因标记为快速精准鉴定和选育高油、高蛋白等优质芝麻新品种提供了可靠途径。危文亮等[11]利用43 对SRAP（相关序列扩增多态性）引物、20 对SSR（简单重复序列标记）引物以及16 对AFLP（扩增片段长度多态性）引物，对216 份芝麻种质资源进行了遗传多样性分析、群体结构分析和油分含量性状关联分析，在2 个环境下重复检测出3个SRAP 标记和5个SSR 标记与油分含量性状极显著关联。LI 等[6]利用自主研发的112 对多态性SSR标记，对来自国内外的369 份芝麻种质进行了5 个环境下的油分含量和蛋白质含量性状的关联分析，发现芝麻油分含量与蛋白质含量呈极显著负相关关系，共有19 个SSR 标记与油分含量紧密连锁，24个SSR 标记与蛋白质含量紧密关联，且2 组中的SSR 标记存在重合现象，进一步证实了芝麻油分含量与蛋白质含量之间存在一定的负相关关系。近几年来，借助于高通量测序技术和芝麻参考基因组信息，人们开展了芝麻油分含量全基因组关联及基因定位克隆研究[13-17]。一批油分含量相关的SSR 标记、SNP（单核苷酸多态性）标记、数量性状QTL及基因被发掘，为加快芝麻品质分子育种提供了重要信息[18]。但是，截至目前，鲜有SSR等分子标记用于高油芝麻种质和品种精准鉴定与评价的报道。鉴于此，为搭建并完善芝麻分子标记辅助育种技术体系，利用自主筛选的24 个多态性SSR 标记，对48 个高/低油分含量芝麻种质开展基因型鉴定，筛选出可以用于准确判定芝麻油分含量水平的SSR 标记，确定高油分相关SSR 标记鉴定方法和优异等位位点信息，为实现优质芝麻分子标记辅助育种提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

48 份芝麻种质由河南省农业科学院芝麻研究中心提供，油分含量在50%以上的样本为高油分样本，低于50%的为低油分样本。2018年6月将48份芝麻种质种植于河南省农业科学院河南现代农业研究开发基地，每个样本种植2 行，行长5 m，行宽40 cm，株距20 cm。采用标准种植管理方式进行管理。采集现蕾期相同部位幼嫩叶片，液氮速冻后，-70 ℃保存，用于DNA 提取。成熟后收获各样本种子，用于品质测定。

1.2 油分含量检测

芝麻籽粒油分含量数据采集采用近红外光谱法进行[12]，利用瑞典Perten 公司生产的DA-7200 型近红外光谱仪测得。测定前，各测试样本籽粒均精选、去除杂质；重复测定2～3次。近红外光谱检测用谱段为950～1 650 nm，采样间隔2 nm。

1.3 SSR引物合成

24 对SSR 标记的引物序列信息参考LI 等[6]获得，引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.4 SSR引物PCR检测

采用CTAB 法（QIAGEN，Hilden，Germany）提取各芝麻样本叶片DNA，用于SSR 标记PCR 扩增和检测。PCR 反应体系：引物对（0.2 μmol/L）4 μL，模板DNA（50 ng/μL）1 μL，10×Buffer（含Mg2+）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，加入无菌双蒸馏水至10 μL。PCR反应程序包括：95 ℃2 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，30个循环；72 ℃5 min，4 ℃保存。

1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳与带型统计

参照魏利斌等[13]的方法对PCR 产物进行9%聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染法染色，然后照相观察。DNA Marker 为DL 500 bp DNA Marker（英迈捷公司，中国）。根据电泳结果统计每个SSR 引物对扩增后形成的位点，以“1”和“0”分别记录等位位点的有无，即：“1”表示“有带”；“0”表示“无带”；“-”表示“缺失”。

1.6 SSR标记数据分析

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，统计并建立24个SSR 标记数据矩阵。利用Excel 进行数据统计；采用DPS统计分析软件进行SSR标记方差分析。

2 结果与分析

2.1 48个芝麻样本的油分含量分布

本研究选用不同油分含量的48 份芝麻样本用于SSR 标记鉴定。首先，采用近红外测定法和标准曲线对各芝麻样本的油分含量进行测定。结果（图1）显示，48 个芝麻样本的油分含量为29.81%～57.86%，平均油分含量为46.91%。48 个芝麻样本的油分含量分布出现2个峰，分别在油分含量35%～40%和50%～55%区间。结合芝麻油分含量水平，把油分含量高于50%的样本归为高油组（编号1—24 号），低于50%的样本归为低油组（编号25—48号）。在48 份芝麻样本中，高油组样本的油分含量为52.74%～57.86%，平均油分含量54.58%；低油组样本的油分含量为29.81%～49.16%，平均油分含量39.24%。2组之间的油分含量差异显著。

图1 48个芝麻样本的油分含量水平分布Fig.1 Distribution characters of oil content in the 48 sesame samples

2.2 SSR标记位点类型分布与芝麻样本油分含量表型相关关系分析

选用自主发掘的与芝麻油分含量和蛋白质含量紧密连锁的24 个SSR 标记[6]，对上述48 份芝麻样本进行PCR 扩增。电泳后统计带型并进行方差分析，结果见图2、表1、表2。PCR带型结果显示，24个SSR 标记在48 个芝麻样本中均呈现出多态性特征。条带数量为2～6 个。例如，Hs393 标记PCR 扩增的产物存在6 个条带，其中4 个为等位变异位点（图2A），携带第1、2、3、4 个变异位点的样本分别有7 份、34 份、1 份（油分含量为39.59%）和2 份（表1）。方差分析显示，在4 个等位变异位点中，第2 个等位变异与第1、4 个等位变异之间均具有极显著差异（P＜0.001）。结合样本表型结果显示，携带有Hs393（4/2）（即第2 个等位变异位点）的34 份芝麻样本平均油分含量为50.08%，其中24 份（64.7%）样本油分含量高于50%。携带有第1、4个等位位点的芝麻样本平均油分含量分别为37.61%、39.57%；携带有第3个等位变异的样本油分含量为39.59%，均属于低油芝麻样本。

表1 4个SSR标记在48个芝麻样本中的等位变异位点统计及差异显著性分析Tab.1 Statistics and significance analysis of allelic variation loci of four SSR markers in the 48 sesame samples

表2 4个SSR标记等位变异位点在48份样本中的带型分布统计Tab.2 Statistical analysis of zonal distribution of allelic variation loci of four SSR markers in the 48 sesame samples

图2 4个标记在芝麻高/低油样本中的扩增结果Fig.2 Amplification results of four SSR markers in sesame samples with high and low oil content，respectively

Hs635 标记的PCR 扩增产物存在2 个等位变异位点（图2B）。携带有第1个和第2个等位位点的样本分别有14份和31份（表1）。2个等位位点之间存在极显著差异（P＜0.01）。在表型方面，携带Hs635（2/1）（即第1 个等位位点）的样本平均油分含量为42.51%；携带Hs635（2/2）（即第2 个变异位点）的样本平均油分含量为49.63%，其中22 份样本（71.0%）油分含量大于50%。可见，Hs635（2/2）标记位点与高油分含量性状存在显著的连锁关系。

对于Hs4082标记，其PCR 扩增产物也存在2个等位位点变异，且差异显著（P＜0.05）（图2C、表1）。其中，携带有Hs4082（2/1）和Hs4082（2/2）变异位点的样本分别有24 份和23 份。带有Hs4082（2/1）位点的样本平均油分含量为49.79%，其中18 份（75.0%）样本的油分含量高于50%；带有Hs4082（2/2）位点的样本，平均油分含量为43.98%，其中15份（65.2%）样本为低油分含量类型。可见，Hs4082（2/1）标记位点与高油分含量性状存在显著连锁关系。

此外，Hs4089 标记的扩增产物存在2 个等位变异类型，且2 个变异之间存在极显著差异（P＜0.001）（图2D、表1）。表型显示，携带Hs4089（2/1）（即第1 个等位变异位点）的样本有21 份，平均油分含量为42.14%；带有Hs4089（2/2）（即第2 个等位变异位点）的样本共有24份，平均油分含量为51.41%，其中19 份（79.2%）为高油分含量材料（＜50%）。表明Hs4089（2/2）标记位点与高油分含量性状存在极显著的连锁关系。

2.3 SSR标记对芝麻油分含量性状鉴定的稳定性分析

为进一步分析上述SSR 标记在芝麻油分含量性状鉴定中的稳定性和可靠性，分析芝麻样本油分含量表型与4个SSR 标记等位变异位点之间的相关关系和频率。在48 份芝麻样本中，共有12 个样本同时携带有4 个SSR 标记的高油带型；且12 个样本（100%）的油分含量均大于50%，均属于高油分含量芝麻样本。12 个样本包括漯芝系列、丰芝系列、豫芝系列等高油品种，以及汉冢万庄、新蔡选抗、武昌迟芝麻等地方农家种。其中，漯芝16的油分含量最高，为57.86%。在48 个样本中，能够同时被检测到携带有3 个及以上高油带型的样本有24 个，油分含量为46.82%～57.86%，平均油分含量为54.03%。其中22 个（91.6%）样本的油分含量高于50%，属于高油分样本；油分含量低于50%的材料仅有2个，分别为墨西哥Yori77-1（油分含量48.19%）和淮阳红芝麻（油分含量46.82%），但其油分含量接近50%。

进一步比较发现，有10个样本被检测到同时携带有3 个及以上的低油带型，油分含量为32.04%～47.77%，平均油分含量为40.60%。在这10 个样本中，有6 个低油分样本，分别为湖南岳阳芝麻、泥里蹲、冀9014、贵州荔波黑芝麻、郑黑芝-3和江苏泰州LZX04，均携带有4 个低油位点标记。上述结果表明，采用与油分含量紧密连锁的4 个SSR 标记联合进行芝麻油分含量水平的判定，结果可靠。

3 结论与讨论

本研究对48 份不同油分含量的芝麻种质开展了油分含量相关分子标记鉴定与评价研究。48 份芝麻种质的油分含量为29.81%～57.86%。利用自主创制的与芝麻油分含量紧密连锁的24个SSR 标记，检测了48份芝麻种质的标记位点类型。结果显示，24个SSR标记在48份芝麻样本中均具有多态性；其中Hs393（4/2）、Hs635（2/2）、Hs4082（2/1）和Hs4089（2/2）4个SSR标记的高油位点与其他等位位点均具有显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.001）差异，筛选出4个与高油分紧密关联的SSR 标记位点，表明SSR标记可以用于芝麻种质油分含量类型的评价和鉴定。在检测的48 个样本中，同时携带这4 个SSR 标记等位变异位点的12 个样本（油分含量52.74%～57.86%）均属于高油分样本，显示出SSR 标记在评价和鉴定特异芝麻种质中的重要作用。因此，在今后高油芝麻新品种选育过程中，可以采用上述SSR标记对低世代材料进行快速筛选，以提高育种效率和准确度[14，18]。此外，本研究通过上述4个SSR标记鉴定出了漯芝系列、丰芝系列、豫芝系列等一批高油品种以及汉冢万庄、新蔡选抗、武昌迟芝麻等高油地方农家种，并筛选出了一批低油分含量种质，为今后搭建芝麻分子标记辅助育种技术体系、选育高油优质芝麻新品种提供了丰富的材料和方法。本研究为进一步完善芝麻分子标记辅助育种、加快优异新品种品质选育提供了技术支持。

芝麻属于小粒型高含油量作物。近年来，芝麻品质相关性状主要涉及油分含量、蛋白质含量、脂肪酸组分以及芝麻素等次生代谢物含量等性状[1，18]。油分含量、蛋白质含量等性状均属于数量性状，由微效多基因控制[18-19]。LI 等[6]分析显示，369 份芝麻种质的油分含量性状受基因型与环境共同影响，基因型的效应更大。因此，发掘与品质性状相关的QTL、基因及分子标记，对提高芝麻品质育种效率具有重要意义。

芝麻品质相关的遗传研究主要涉及重要分子标记发掘、QTL 图谱定位、全基因组关联分析及基因克隆等方面[19-22]。在分子标记发掘与应用中，SSR标记是指1～6 bp 的短序列重复序列，大量存在于植物基因组中，因其具有多样性和重复性的特点，被广泛用于农作物种质及品种的特异性分子鉴定、重要性状关联分析等工作[23-27]。DIXIT 等[28]首次开发了芝麻SSR 标记。在芝麻基因组中，约有110 495个SSR 存在，其中单核苷酸类（Mononucleotide）和二核苷酸类（Dinucleotide）重复分别占总量的39.1%和34.3%。根据文献所知，目前已发掘出的与油分含量性状紧密连锁的SSR 标记共有29 个[6，11]。其中，LI 等[6]开展了369 份芝麻种质5 个环境下油分含量和蛋白质含量的关联分析，确定了24个SSR 标记与油分和蛋白质含量紧密连锁。此外，WU 等[29]依据SNP 遗传图谱开展了油分含量、蛋白质含量及芝麻素含量3 个品质性状的QTL 定位，发掘了5 个与油分含量紧密关联的QTL 位点，对表型变异的解释率为5.2%～18.6%。

近几年来，芝麻基因组计划及芝麻基因组精细图谱的完成为芝麻品质相关性状遗传研究提供了重要技术和信息支撑[19，30-34]。WEI等[17]对705份芝麻种质进行了全基因组重测序和关联分析，研究了包括油分含量等56 个农艺性状在4 个不同环境下的关联SNP 位点分布。ZHOU 等[35]通过全基因组关联分析定位了3 个与油分含量紧密关联的功能基因（NAC，SiTPS1和SiKAS1），为芝麻优质育种提供了分子元件。今后将进一步开展芝麻油分含量等品质性状的遗传解析，以构建完善的分子标记辅助育种技术体系，加快芝麻品质育种研究进程。