基于ITS 和ISSR 的灵芝种质资源遗传多样性分析

许 琳，张 瑞，王 胜，李金涛，刘琳玲，闫梅霞

（1.中国农业科学院 特产研究所，吉林 长春 130112；2.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118）

灵芝（Ganoderma lucidum）是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，为我国传统名贵药材，被称为“仙草”，在我国已有上千年的栽培及应用历史。我国是世界上最大的灵芝生产国和消费国，2020 年灵芝和灵芝孢子粉合计年产量约1.7 万t，产业总产值超过80 亿元[1]。灵芝子实体开展药食同源试点管理[2]、破壁灵芝孢子粉保健食品实施备案制[3]等利好政策的实施将进一步促进灵芝产业健康发展。目前，我国灵芝主栽区包括武夷山及龙泉、东北吉林长白山、安徽大别山、山东鲁西四大区域[4]。吉林作为灵芝主要栽培区之一，主要栽培品种为赤芝、松杉灵芝、韩芝等[5]，存在灵芝种源引进随意、来源不清晰的问题，不利于灵芝良种选育工作的开展。因此，有关栽培菌株的鉴定及遗传多样性分析的研究亟需提上日程。

核糖体DNA 内转录间隔区（Ribosomal DNA internal transcribed spacer，rDNA-ITS）基因是目前真菌属内种间鉴定可靠的基因片段[6]，在物种和亚种水平上的识别信息最为丰富[7]。研究表明，ITS 对于灵芝多数种类来说是可靠的区分方法，我国具有ITS 分子序列的灵芝种类有39 种[8]，因此，近年来被广泛应用于灵芝种质资源的鉴定及评价[9-10]。拮抗试验操作简单且成本低，常用于菌株的初步鉴定及分类[11]，也可有效反映遗传多样性[12-13]。简单序列重复间隔区（Inter-simple sequence repeat，ISSR）标记是对2 个彼此相近、方向相反的简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）之间DNA 区域进行扩增[14]，其模板质量要求低，具有很好的稳定性和多态性，常用于菌株的筛选、鉴定及遗传多样性分析[15]等。目前，在对食用菌进行鉴定及遗传多样性分析时，常采用上述拮抗试验、ITS 序列分析与分子标记手段中的2 种或3 种方法相结合进行，其结果也更加准确可靠[16-19]。

目前尚未见关于吉林地区灵芝遗传多样性研究的报道，鉴于此，拟通过拮抗试验结合ITS 序列对供试菌株进行鉴定，构建系统发育树，并利用ISSR分子标记构建遗传聚类图谱，对吉林主栽的18种灵芝菌株进行遗传多样性分析，以期为吉林栽培灵芝的遗传育种及生产利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

18 个灵芝供试菌株由吉林省5 个灵芝产区所取子实体分离纯化所得，菌株现由中国农业科学院特产研究所食药用菌团队保存，灵芝菌株编号见表1。

表1 供试菌株Tab.1 Tested strains

1.2 试剂与仪器

主要试剂：Ezup 真菌基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）、ITS 引物及ISSR 引物（上海生工生物工程股份有限公司）、2×TaqPCR Master Mix（上海生工生物工程股份有限公司）、DL2000 DNA Marker（日本宝生物工程株式会社）、50×TAE 缓冲液（北京博奥拓达科技有限公司）。

主要仪器：D3024R 高速冷冻离心机（美国赛洛捷克公司）、T100 PCR 仪（美国伯乐公司）、JW300C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）、凝胶成像分析系统（美国伯乐公司）、OSE-260 超微量紫外可见分光光度计（天根生化科技有限公司）。

1.3 培养基配制

马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）:马铃薯200 g（浸汁）、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1.5 g、磷酸氢二钾1.5 g、无水硫酸镁2 g、琼脂20 g，加水定容至1 L，pH值自然。

1.4 菌丝培养与DNA提取

将活化的18 种灵芝菌株接种到铺有玻璃纸的PDA培养基平皿上，3次重复，25 ℃避光培养。待菌丝长满平皿后刮取菌丝，按照试剂盒方法逐一提取DNA，并检测DNA质量，A260/A280值为1.8～2.0则质量合格，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 ITS扩增

选 择 真 菌 通 用 引 物 ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ） 和 ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′）对样品DNA 进行扩增。反应体系为25 μL，包含2×PCR Mix 12.5 μL、上下游引物各1.25 μL、DNA 模板1.25 μL、ddH2O 8.75 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min，终止温度为4 ℃。配制1%的琼脂糖凝胶、1×TAE 电极缓冲液，上样量3 μL，120 V 电压恒流30 min，检测是否有目的条带。

1.6 拮抗试验

18 种灵芝菌株在PDA 培养基活化后，采用陈强[20]等的方法使用直径6 mm 的打孔器打取各菌株种块，接种于直径90 mm 的培养皿内25 ℃对峙培养，每个菌株至少3 次重复。菌丝接触3 d 后，观察记录菌株两两之间的拮抗情况。

1.7 ISSR引物筛选及扩增

参照徐凯[21]、邢志伟[22]、RAMAN 等[23]的方法，对20 个常用ISSR 引物进行分析，筛选出12 条扩增条带清晰、多态性强、稳定性好的引物，同时筛选各引物适宜的退火温度。筛选的引物序列及确定的适宜退火温度见表2。

表2 ISSR引物参数Tab.2 ISSR primer parameters

反应体系为20 μL，包含2×PCR Mix 10 μL、引物1 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 8 μL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min、退火1 min、72 ℃延伸1 min，40 个循环；72 ℃延伸5 min，终止温度为4 ℃。配制1.5%的琼脂糖凝胶、1×TAE 电极缓冲液，上样量5 μL，以DL 2000 Marker 为指示标量，120 V 电压恒流1 h，于凝胶成像系统上检测并拍照记录。

1.8 数据处理

将PCR 扩增产物交由上海生工生物工程股份有限公司进行测序，所测得的ITS 序列使用SnapGene v5.5.3软件检查质量，并检查峰图，人工校正后用MEGA X 软件以邻接（Neighbor-joining，NJ）法对所得序列构建系统发育树并计算遗传距离，以Bootstrap 方法对系统发育树进行评估，Bootstrap 次数设置为1 000。依据ISSR 扩增电泳图，选择清晰可辨的电泳条带，分别读取数据，相同迁移率处有带为1，无带为0，建立0/1矩阵，应用NTSYS-pc 2.10软件基于DICE 系数计算遗传相似系数，按照非加权平均法（UPGMA）聚类分析。

2 结果与分析

2.1 18种灵芝菌株的ITS系统发育分析

测序获得18 种灵芝菌株的ITS 序列，经对位排列，人工矫正后长度为576～580 bp，在GenBank中下载 多 孔 菌 目 香 菇 属（Lentinus arcularius，MH142022.1）ITS 序列，长度为648 bp。将其作为外群，将经测序的18种灵芝菌株和GenBank 中已登录的12 条灵芝菌株ITS 序列通过NJ 法构建系统发育树，结果见图1。灵芝属内12 条ITS 序列同一种不同菌株很好地聚在一起；赤芝（Ganoderma lingzhi）与柯蒂斯灵芝（Ganoderma curtisii）聚在一支，支持率为86%；18 种灵芝菌株均与赤芝聚为一类，并可进一步分为2个类群，即类群Ⅰ和类群Ⅱ，支持率为96%。在类群Ⅰ进化分支中可继续分为组a（LZ-2、LZ-13、LZ-15、LZ-16、LZ-18）和组b（LZ-4、LZ-11、LZ-12、LZ-14、LZ-17），支持率为64%；类群Ⅱ被分为组c（LZ-7、LZ-8）和组d（LZ-1、LZ-3、LZ-5、LZ-6、LZ-9、LZ-10），支持率为47%。经各菌株间及组间序列对比发现，18种灵芝菌株各组内各菌株序列相似性为100%，组间序列相似性在99.29%～99.65%。

图1 基于18种灵芝菌株ITS序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on the ITS sequences of 18 Ganoderma lucidum strains

2.2 18种灵芝菌株的拮抗试验结果分析

对18 种灵芝菌株共设计拮抗试验153 组，其中有拮抗现象的有122 组，占比79.7%；无拮抗现象的31 组，占比20.3%。多数拮抗现象表现为形成一条沟带。根据ITS 分组结果对组内及组间拮抗现象进行分析（表3）。组a 与组b 之间均有拮抗现象；组a内LZ-13、LZ-15、LZ-18 之间无拮抗现象；LZ-2 与LZ-7 之间无拮抗；LZ-16 与组d 内LZ-3、LZ-9 拮抗不明显，但与组d 内LZ-1、LZ-5、LZ-6、LZ-10 拮抗明显；组b 组内5 个菌株之间均无拮抗现象；组c 与组d 之间均有拮抗现象；组c 内两菌株同样有拮抗现象；组d 内6 个菌株之间均无拮抗现象。拮抗试验结果与ITS 试验结果大体一致。组a 内LZ-13、LZ-15、LZ-18，组b、组d 各组内菌株亲缘关系均较近，可初步判断为同一菌株；LZ-8 与其余各菌株均有拮抗现象，可判断为单一菌株；LZ-2、LZ-7、LZ-16 疑似单一菌株，但需进一步鉴定。通过ITS 扩增和拮抗试验，将18种灵芝菌株分成7组：LZ-13、LZ-15、LZ-18 为一组，组b、组d、LZ-2、LZ-7、LZ-8、LZ-16各自为一组）。

表3 18种灵芝菌株的拮抗试验结果Tab.3 Results of antagonism tests of 18 Ganoderma lucidum strains

2.3 18种灵芝菌株的ISSR遗传多样性分析

2.3.1 ISSR 引物多态性 通过对20 条ISSR 引物进行温度梯度试验后，确定的12 条ISSR 引物的退火温度在43～56 ℃，其在18种灵芝菌株中扩增出91条清晰稳定的条带（表4），DNA 片段大小在100～2 000 bp（图2）。其中，ISSR-6 引物扩增条带最多（12条），ISSR-4和ISSR-12引物扩增条带最少（4条），平均为7.6 条。各ISSR 引物的多态性条带数为3～12条，平均为6.8条，多态性位点百分率为87.2%。

图2 18种灵芝菌株ISSR-3（A）、ISSR-5（B）引物的ISSR扩增图谱Fig.2 ISSR fingerprints generated using primers ISSR-3（A）、ISSR-5（B）of 18 Ganoderma lucidum strains

表4 18种灵芝菌株的ISSR引物多态性Tab.4 ISSR primer polymorphisms of 18 Ganoderma lucidum strains

2.3.2 18 种灵芝菌株的聚类分析 18 种灵芝菌株的遗传相似系数在0.382 4～0.974 4，平均为0.652 9，遗传范围差异较大（表5）。其中，LZ-14和LZ-17之间的遗传相似系数最大，为0.974 4，表明两者的亲缘关系最近，遗传差异最小；其次是LZ-11和LZ-12，遗传相似系数为0.970 6；LZ-8和LZ-11的遗传相似系数最小，为0.382 4，表明两者的亲缘关系最远，遗传差异较大。

表5 18种灵芝菌株的遗传相似系数Tab.5 Genetic similarity coefficient of of 18 Ganoderma lucidum strains

基于18 种灵芝菌株的ISSR 遗传多样性结果进行聚类分析，可将18 种菌株分开（图3）。在遗传相似系数约0.550 处，所有菌株被分为2 个类群；在遗传相似系数约0.569 处，所有菌株被分为4 个类群，除LZ-7 外，其余分组与ITS 结果相同。当相似系数约0.679 时，18 种灵芝菌株可分为7 个类群：LZ-2、LZ-7、LZ-8、LZ-16各自成为一个类群，LZ-1、LZ-3、LZ-5、LZ-6、LZ-9、LZ-10 为 一 个 类 群，LZ-13、LZ-15、LZ-18 为一个类群，LZ-4、LZ-11、LZ-12、LZ-14、LZ-17 为一个类群。该聚类结果与基于ITS扩增和拮抗试验分类的结果相同。

图3 18种灵芝菌株的ISSR聚类分析Fig.3 ISSR cluster diagram of 18 Ganoderma lucidum strains

3 结论与讨论

目前，多种方法可用于食用菌的鉴定及遗传多样性分析[24-25]，每种方法所提供的遗传信息不同，因此，对于其遗传关系的反映有所差异，多种方法相结合可以更加准确可靠地反映分析结果。ITS 技术可以有效对灵芝菌株进行分类，研究认为，当序列相似性达99%以上，可认为是同一个种[26]。汤坤鹏[27]利用ITS 技术将18 种野生灵芝菌株分为六大类，其中包括赤芝、紫芝、松杉灵芝等。既往研究中，对于菌株分类常用样本序列进行Blast 对比，但由于18 种灵芝菌株亲缘关系较近，ITS 序列差距较小，且GenBank 数据库中有关灵芝ITS 的序列多、质量参差不齐[8]，可靠性有待进一步查证。因此，本研究选择亲缘关系较近的5 个不同种，参考现有文献[28]中分类学已明确的12 条灵芝菌株ITS 序列，与经测序的样本序列构建系统发育树。结果表明，赤芝与柯蒂斯灵芝聚为一类，支持率为86%，其亲缘关系较其他种更近，与前人研究结果相同[28-29]；18种灵芝菌株均与赤芝聚为一类，可进一步分为2 个类群，支持率为96%，2 个类群各自独立进化为2 个分支。体细胞的非亲和性往往导致菌丝体间出现明显的分界线，即出现拮抗反应，表现为色素沉淀、形成一条拮抗线、沟带或隆起[30]。拮抗反应操作简单、便捷，结果直观，是14 种食用菌新品种DUS 测试指南中的测试项目之一。研究认为，2 个菌株对峙培养，若没有拮抗反应，不能判定为同一菌株，需进一步鉴定[20]，拮抗试验常用于辅助其他手段进行菌株的鉴定及分析亲缘关系[13，31]。崔筱等[32]在对河南主产区香菇进行种质资源鉴定及遗传多样性分析时认为，ITS+拮抗试验法可以明确区分遗传距离的差异及亲缘关系的远近，与本研究结果相似，通过ITS+拮抗法将18种灵芝菌株分为7个类群。

分子标记是以DNA 多态性为基础反映遗传多样性的一种手段。王艳等[33]采用ISSR 和相关序列扩 增 多 态 性（Sequence related amplified polymorphism，SRAP）综合分析灰树花遗传多样性时发现，ISSR扩增检测到的位点数比SRAP多，多态性比率比SRAP 高，相比于其余分子标记手段，其具有多态性丰富、操作简单、无需提前知道基因组相关序列信息等优点[29]。通过ISSR 分子标记技术，陈小敏等[34]将四川省12 个野生灵芝菌株在相似系数为0.54 时聚为两大类，张彬彬等[35]将河南省30 个野生灵芝菌株在相似系数为0.728 时分为六大类。王锦锋等[36]利用拮抗、ITS 和随机扩增多态性（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术对21 株灵芝菌株进行研究，认为3种方法结果一致，且能准确鉴定其亲缘关系。本研究采用ITS+拮抗试验法和ISSR 技术相结合对吉林地区18 种栽培灵芝菌株进行鉴定及遗传多样性分析。基于ISSR结果，在遗传相似系数约0.550 时，分为2 个类群；在遗传相似系数约0.569 时，分为4个类群。ISSR 分类结果表明，其在遗传相似系数约0.679 处与ITS+拮抗试验法分类结果一致。本研究中，18种灵芝菌株具有丰富的遗传多样性。