中药单体调控非受体型酪氨酸激酶抗肿瘤的研究进展*

胡玉洁,魏兰懿,陈君君,周阳云,杨姣,胡九东,韩永龙

(上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海 200233)

癌症是世界范围内重大的公共健康问题,也是第二大死亡原因。以化学治疗(化疗)为基础的内科综合治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段,但化疗药物在抑制肿瘤生长的同时,会产生严重的毒副作用,抑制机体免疫功能、骨髓造血功能等,且长时间使用会引起耐药,降低疗效[1]。随着医学的发展进步,靶向治疗药物不断涌现,为癌症患者带来了福音。截至2021年,已有48种以酪氨酸激酶为靶点的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)被列入癌症治疗药物清单[2]。蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)的活化是启动DNA合成和细胞增殖中多细胞反应的关键信号,PTK的异常激活还与细胞的恶变和异常增殖有关。因此,PTK在肿瘤的发生、发展过程中有着极其重要的作用。酪氨酸激酶作为蛋白激酶家族的一个主要分支,根据其结构、功能和在细胞中的位置,可将其分为受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)和非受体酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinases,NRTK)。与RTK比较,NRTK既缺乏细胞外配体结合域,也缺乏跨膜结构域,主要定位于细胞质区,或与细胞膜结合,通过与细胞因子、生长因子和激素等跨膜受体相互作用来执行信号转导功能。NRTK表达异常或者活性改变,通常是恶性肿瘤的发生和发展的重要原因[3]。以NRTK为靶点的TKIs已被广泛用于癌症的治疗,例如,甲磺酸伊马替尼作为首个靶向NRTK家族中BCR-Abl蛋白激酶抑制剂,主要用于治疗慢性粒细胞性白血病和胃肠间质瘤,但随之而来的获得性耐药及严重的毒副作用限制了其应用[4]。因此以NRTK为靶点,寻找低毒高效的抑制剂是开发抗癌药物的重要思路。

中国传统医药在抗肿瘤治疗方面有着多靶点、多通路、低毒、增效、经济的独特优势,诸多中药复方、中成药和中药单体已广泛应用于肿瘤临床治疗[5]。中药散结通络颗粒联合唑来膦酸注射液抑制恶性肿瘤的骨转移,康艾注射液联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌均取得良好的效果[6-7]。但中药成分复杂,治疗作用通常受多种成分之间相互作用的影响,因此深入研究中药作用机制,必须先明确中药中发挥药效的单体成分。近年来国内外已有大量研究发现,多种中药单体可通过抑制NRTK发挥抗肿瘤作用,如木犀草素可通过抑制Janus激酶/信号转导和转录激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)信号通路,抑制胃癌细胞增殖[8];五味子甲素可以通过降低胰腺癌细胞中表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)和Src表达水平,减少黏着斑相关蛋白Fak和Paxillin的表达,抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭[9]。笔者介绍NRTK的生理病理特点,汇总了近年来作用于NRTK发挥抗肿瘤作用的中药单体,以期为靶向NRTK的抗肿瘤治疗提供理论基础,为寻找NRTK的中药单体抑制剂提供参考。

1 NRTK与肿瘤的关系

目前为止,已发现的NRTK包括Src、Abl、Jak、Fak、Ack、Csk、Fes、Tec和Syc等9个家族[10]。所有9个家族在Src同源结构域2(SH2)和Src同源结构域3(SH3)中具有高度同源性。SH2结构域负责结合蛋白质上的磷酸酪氨酸,而SH3结构域则与蛋白质中富含脯氨酸的区域结合,介导蛋白质-蛋白质的相互作用[11-12]。NRTK的催化结构域(SH1)是具有特定ATP结合位点的酪氨酸残基,其被磷酸化激活后,通过激活不同的信号过程,导致细胞活化和发育、增殖、分化和存活的变化。作为细胞信息传递的关键节点,NRTK的异常表达和激活会影响其下游信号通路的正确激活,进而导致细胞过度增殖、迁移、侵袭等异常变化,最终导致肿瘤形成。NRTK家族中各激酶的活化在肿瘤形成和进展等生物学过程中发挥重要作用。

1.1Src家族与肿瘤 Src家族蛋白酪氨酸激酶(src-family protein tyrosine kinases,SFK)是NRTK中最大的一个家族,由9个具有相似结构和功能的成员组成,包括Src、Lck、Hck、Blk、Fyn、Lyn、Fgr、Yes和Yrk[13]。SFK,尤其是Src和Fyn,参与细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和其他细胞的粘附。Src通过一个N末端脂肪酸部分与质膜结合,当被激活时,会转移到膜-细胞骨架界面的位置,从而促进粘附连接和局灶性粘附的转化,诱导细胞迁移,而缺乏Src、Yes和Fyn的细胞表现出纤维连接蛋白上的细胞迁移减少[14]。还有研究表明Src和EGFR可以直接结合,从而相互磷酸化和活化。EGFR被配体激活后,可以与Src形成复合物,进而磷酸化激活磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 (serine-threonine kinase,Akt)和MAPK途径,进而诱导细胞生存和迁移信号通路[15]。已发现大多数非小细胞肺癌患者存在激活的EGFR突变,这是产生EGFR抑制剂耐药性的主要原因,而许多研究证实Src抑制剂能够克服非小细胞肺癌患者对EGFR抑制剂的耐药性[16]。

1.2Jak家族与肿瘤 Janus激酶家族(Janus kinase family,Jaks)由4个成员组成:Jak1、Jak2、Jak3和酪氨酸激酶-2(tyrosine kinase 2,TYK2)[17]。目前,研究最多的JAK/STAT信号通路被认为是细胞功能的中心通讯节点之一。Jaks与细胞因子受体非共价结合,介导受体的酪氨酸磷酸化,并招募一个或多个STAT蛋白。酪氨酸磷酸化的STATs二聚化,然后通过核膜运输到细胞核以调节特定基因的表达[18]。研究表明,JAK/STAT信号可能通过触发核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)激活,活性NF-κB启动基因的表达,可以使癌细胞保持增殖并保护其逃避凋亡信号[19]。活化的Jaks也能激活下游的MAP激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)转导途径,MAPK级联激活是细胞增殖、应激、炎症、分化、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一,MAPK/ERK通路的激活被认为参与了造血系统恶性肿瘤、胃癌、卵巢癌和胰腺癌等癌症的发病机制[20]。

1.3Abl家族与肿瘤 Abelson酪氨酸激酶(Abelson tyrosine kinase,Atk)家族包括2个成员:c-Abl和Arg(Abl related gene product)。c-Abl是慢性髓系白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)等造血系统恶性疾病发生所必需的,c-Abl与B细胞抗原受体(B-cell receptor,Bcr)融合而形成的Bcr-Abl癌蛋白,具有促进白血病细胞生长优势的组成性激酶活性,即Bcr与Abl的融合赋予Abl更强酪氨酸激酶活性,这种激酶活性不需要诱导,而处于持续活化状态[21]。Bcr-Abl癌蛋白与其他细胞质分子之间的异常相互作用导致关键细胞过程的中断,如Ras/MAPK通路异常导致细胞增殖增加,PI3K/Akt通路异常可保护细胞免受程序性死亡,促进癌症的进展。此外c-Abl激酶最具进化保守性和特征性的功能是其调节细胞骨架动力学的能力。c-Abl通过其肌动蛋白结合域与肌动蛋白丝结合,导致肌动蛋白细胞骨架重组,这是形成细胞迁移和侵袭所必需的[22]。活性c-Abl激酶也是钙粘蛋白依赖性粘附连接的维持和重塑所必需的。c-Abl和Arg同时失活会破坏成纤维细胞和上皮细胞的粘附连接[23]。

1.4Fak家族与肿瘤 粘着斑激酶(focal adhesion kinase family,Fak)家族由2种激酶组成:富含脯氨酸的Fak和富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)[24]。Fak由包含FERM结构域(由four point on,ezrin,radixin和moesin 等4个蛋白组成)的N端、中央激酶结构域和带有脂肪结构域的C端组成,其中FERM结构域被证明可与血管内皮钙粘蛋白的胞质区结合,这在肿瘤血管生成中至关重要[25]。此外,Fak下游有两条促进癌细胞迁移的途径。第一种是通过Src介导的,第二种是通过PI3K介导的。Fak作为整合素信号通路中的关键调节分子,可以与Src形成复合物,进而磷酸化一系列下游分子,如p130Cas、paxillin、ERK等,来调节肌动蛋白细胞骨架重组,从而促进细胞迁移[26]。Fak也可能通过PI3K和Akt阻止癌细胞凋亡,并通过Src介导的Pax磷酸化促进癌细胞扩散[27]。在人卵巢癌、结直肠癌和乳腺癌中已观察到Fak的过度表达,提示Fak在癌症发展中的作用。

1.5其他家族与肿瘤 除了上述非受体酪氨酸激酶家族,Tec家族在癌症的作用也逐渐引起人们的注意。Tec家族激酶主要表达于造血起源的细胞中,由4个成员组成:布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)、诱导性T细胞激酶(IL2-inducible T-cell kinase,Itk)、肝细胞癌中表达的酪氨酸激酶(iyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma,Tec)、骨髓表达激酶(bonemarrow-expressed kinase,Bmx)[28]。研究表明,Btk通过调节ERK、Akt/mTOR、IKK、NF-κB和其他癌症相关途径参与恶性B细胞的存活和增殖[29]。在B细胞淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌和胃癌等肿瘤细胞中检测到Btk异常激活和过度表达。

2 中药单体抑制非受体型酪氨酸激酶发挥抗肿瘤作用

中医药治疗作为我国传统的治疗方法,在肿瘤的治疗和辅助治疗中发挥了巨大的优势。而中药单体作为中草药中的有效活性成分,许多国内外研究发现其可以通过作用于NRTK而发挥抗肿瘤作用(图1)。

EGFR:表皮生长因子受体;Src:Src家族蛋白酪氨酸激酶;Jak:Janus激酶家族;BCR-Abl:Abelson酪氨酸激酶和B细胞抗原受体融合蛋白;Fak:粘着斑激酶家族;Max:Myc关联因子X蛋白;HSP90:热休克蛋白90。

2.1中药单体抑制Src家族发挥抗肿瘤作用 Src作为一种酪氨酸的专一性蛋白激酶,可以激活多种下游信号通路而影响癌症的发生和发展。中药单体通过降低Src的表达水平,使p-Src在细胞内含量降低达到抑制下游效应器的作用。血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的关键因素,ZHANG等[30]发现柴胡皂苷A(saikosaponin A)以剂量依赖性方式降低VEGF诱导的VEGFR2的磷酸化及其下游信号通路,包括PLCγ1、Fak、Src和Akt,从而有效抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管形成,这种抗血管生成作用在体内移植瘤模型中也产生显著的抗肿瘤活性。LI等[31]用胡椒碱(piperine)处理石胆酸诱导的结直肠癌细胞,石胆酸可以通过激活Src/EGFR信号通路刺激人结直肠细胞中白细胞介素(interleukin,IL)-8的表达,而胡椒碱可以抵消这种作用,抑制IL-8介导的肿瘤微环境中的血管生成。LI等[32]发现重楼皂苷Ⅱ(polyphyllin Ⅱ)可以通过下调结直肠癌细胞中p-Src、p-mTOR和p-STAT3蛋白质水平,诱导G2/M期细胞周期阻滞、自噬和凋亡,达到治疗结直肠癌的目的。ZHANG等[33]研究发现苦参碱(phenserine)通过阻断Src激酶结构域中Tyr419的自磷酸化,以非ATP竞争方式抑制Src激酶活性,并下调其下游MAPK/ERK、JAK2/STAT3和PI3K/Akt磷酸化信号通路,以抑制癌细胞的增殖。JIANG等[34]从丹参中提取二氢丹参酮Ⅰ(dihydrotanshinone Ⅰ)进行研究发现,二氢丹参酮Ⅰ能直接与Src相结合,以剂量依赖性地抑制Src和STAT3磷酸化,进而抑制Cyclin D1、Cyclin D3和CDK4的表达,从而诱导G1期阻滞并影响细胞周期进程,下调抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2和PARP的表达,并通过线粒体途径诱导细胞凋亡,从而抑制肝细胞癌的进展。此外,芦荟大黄素(aloe-emodin)[35]和蝙蝠葛碱(dauricine)[36]等也能通过直接与Src结合,从而抑制其磷酸化激活。

2.2中药单体抑制Jak家族发挥抗肿瘤作用 针对Jaks这一靶点,已经发现了许多来自天然植物的活性成分。Jak/STAT信号通路是细胞内一条重要的信号通路,Jak/STAT的过度活化可以促进细胞增殖、调节细胞周期以及抑制肿瘤细胞凋亡,寻找以Jak/STAT为靶点的抑制剂是对抗癌症的一个重要策略。QIU等[37]通过网络药理学研究发现槲皮素(quercetin)治疗乳腺癌所影响的主要通路是Jak/STAT1,槲皮素处理后,乳腺癌细胞中p-Jak2和p-STAT1的蛋白水平增加,从而下调了下游程序性细胞死亡1配体的表达,使T细胞得以正常发挥免疫作用。GUO等[38]发现来自仙茅的天然成分仙茅苷(curculigoside)可以在体内外下调Jak2、STAT3和NF-κB的磷酸化水平,从而抑制下游凋亡相关蛋白(C-caspase-3、Bax和Bcl-2)和上皮-间充质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白(N-cadherin、Snail和E-caherin),抑制骨肉瘤进展。ZHANG等[39]发现葫芦素B(cucurbitacin B)可以通过下调Jak2和STAT3磷酸化状态,同时抑制其由细胞质向细胞核的移位,降低M2样巨噬细胞的极化,抑制结直肠癌细胞迁移。刘宁等[40]研究发现白头翁皂苷A(pulsatilla saponin A)通过抑制Burkitt淋巴瘤Raji细胞内 Jak2/STAT3 信号通路中Jak2、STAT3磷酸化蛋白的活化,将Raji细胞阻滞在G2期,诱导其凋亡。当然,野黄芩苷(scutellarin)[41]、和厚朴酚(honokiol)[42]和α-藏花素(crocin)[43]等天然活性成分也可以通过作用于Jak/STAT通路阻滞癌症的进展。STAT被Jak磷酸化后发生二聚化,然后穿过核膜进入核内调节相关基因的表达,因此阻断Jak对STAT的二聚化激活也能有效抑制癌症的发生发展。VUNDAVILLI等[44]将微分方程方法应用于骨肉瘤途径,并根据药物组合对骨肉瘤肿瘤细胞的杀伤效果对其进行排序,结果发现隐丹参酮(cryptotanshinone)及其组合对多种突变的骨肉瘤细胞具有抑制作用,机制研究发现隐丹参酮通过抑制Jak阻断STATs二聚化,从而抑制骨肉瘤细胞增殖。

2.3中药单体抑制Abl家族发挥抗肿瘤作用 靶向Abl家族的中药单体主要应用于CML的治疗。BCR-Abl融合蛋白是CML最具特征的生物标志物,当BCR与Abl基因融合后,改变了Abl负调控位点的构象,使其处于持续活化构象,从而诱发细胞增殖和肿瘤形成。因此,阻断BCR-Abl磷酸化、下调BCR-Abl的表达以及促进BCR-Abl融合蛋白降解是中药单体抑制CML进展的主要途径。ZHANG等[45]使用甲基莲心碱(neferine)与伊马替尼联合处理慢性粒细胞白血病细胞发现,两者联用显著降低了细胞中BCR-Abl和分子伴侣热休克蛋白90(HSP90)mRNA和蛋白水平,HSP90可以结合并稳定BCR-Abl以防止其降解。此外,甲基莲心碱还降低了p-Erk1/2和Mcl-1的表达,逆转伊马替尼耐药。土荆皮乙酸B也能通过促进BCR-Abl降解抑制CML进展,JIANG等[46]研究发现土荆皮乙酸B(pseudolaric acid B)通过半胱氨酸蛋白酶依赖性切割下调CML细胞中BCR-Abl蛋白表达,并抑制了下游抗凋亡Bcl-2家族蛋白,激活了下游caspase家族,最终导致细胞增殖抑制、细胞毒性和凋亡。GU等[47]发现益母草的主要活性成分水苏碱(stachydrine),通过降低CML细胞系WT和T315I细胞中的p-BCR-Abl和p-Src蛋白表达,抑制CML干/祖细胞增殖、存活和分化,逆转BCR-Abl酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。GAO等[48]研究发现从植物钩藤中提取的去氢硬毛钩藤碱(hirsuteine)可以抑制CML细胞中BCR-Abl磷酸化,从而抑制下游PI3K/Akt信号通路活化,从而将细胞阻滞于G2/M期、最终诱导细胞凋亡。除此之外,木犀草素(luteolin)[49]也能通过调控BCR-Abl蛋白表达及PI3K/Akt信号通路来抑制CML细胞增殖。

2.4中药单体抑制Fak家族发挥抗肿瘤作用 Fak作为黏着斑的主要组成成分,其异常活化常引起细胞的迁移和侵袭能力增高。针对乳腺癌、宫颈癌、肺癌等极易发生转移的肿瘤的治疗,研究发现许多中药单体通过调控Fak抑制其迁移和侵袭,延缓癌症进程。Paxilin是一种细胞骨架蛋白,在粘着斑接触处与Fak共定位,是Fak的下游靶点,而Fak-paxillin信号通路则被认为参与了肿瘤细胞的迁移和侵袭,金雀异黄酮(genistein)是一种天然植物雌激素,CHEN等[50]研究证明金雀异黄酮通过剂量依赖性抑制FAK和paxillin的蛋白磷酸化,从而阻滞了宫颈癌的进展。WANG等[51]发现褐藻黄质(fucoxanthin)也可以以浓度依赖性方式抑制乳腺癌MCF-7细胞中Fak、p-Fak、Paxillin和p-Paxillin的表达,从而抑制MCF-7细胞的运动、侵袭和跨内皮迁移能力。CHEN等[52]研究发现蛇床子素(osthole)可以直接靶向整合素α3(integrin alpha 3,ITGα3)和整合素β5(integrin beta 5,ITGβ5),通过抑制下游的Fak/Src/Rac1信号通路来减弱乳腺癌细胞的迁移和侵袭。ZHU等[53]研究发现从中药麦冬中提取的甾体糖苷——麦冬皂苷D(ophiopogonin D)与转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1结合后,有效地消除ITGβ1的表达,从而减少下游Fak、Src和Akt的磷酸化,从而抑制三阴性乳腺癌细胞的体外生长和转移行为。GUO等[54]研究发现隐丹参酮(cryptotanshinone)通过促进癌基因c-Myc编码的蛋白的泛素化并破坏其与伴侣蛋白Max的相互作用来降解该蛋白,而c-Myc的减少可以减弱Fak信号通路,最终抑制卵巢癌OVCAR3和HEY A8细胞的增殖、迁移和侵袭。此外,诸多研究发现许多中药单体如紫草素(shikonin)[55]、熊果酸(ursolic acid)[56]和冬凌草甲素(oridonin)[57]等则是通过抑制Fak及其下游MAPK/ERK、PI3K/Akt和GSK-3β等信号通路磷酸化激活而发挥抗肿瘤作用。

2.5中药单体抑制其他家族发挥抗肿瘤作用 除了上述主要的家族外,SONG等[58]研究发现杨梅素(myricetin)可以通过氢键与BTK活性袋中的Ala478、Leu408和Thr474关键残基可逆结合,抑制BTK激酶的活性,阻断BTK/ERK和BTK/Akt信号级联,达到抑制TMD-8淋巴瘤细胞增殖并诱导其凋亡的作用。全转录组测序综合分析发现肉桂醛(cinnamaldehyde)也可以作用于BTK,在体外抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,诱导凋亡,并抑制其迁移和侵袭[59]。

3 结束语

抗肿瘤药物的研发是世界各国医药学界的研究重点,而以病理过程中关键作用酶或受体为靶点的分子靶向药物研究已逐渐成为该领域的主流趋势。NRTK家族是一个庞大的、复杂的家族,NRTK活性与癌症的发生和发展有关,活化的NRTK可以激活下游MAPK/ERK、Jak/STAT3和PI3K/Akt信号通路,进而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、迁移和侵袭等生物学过程。然而,以NRTK为靶点的抑制BCR-Abl融合蛋白治疗慢性粒细胞白血病的伊马替尼出现的耐药性,以及新一代的抑制剂,包括达沙替尼(dasainib)和尼罗替尼(nilotinib)等导致的心血管事件、糖尿病、胸腔积液和感染的风险,使得深入研究NRTK的结构及其在癌症中的复杂作用对于抗肿瘤药物的开发至关重要[60]。BTK抑制剂泽布替尼(zanubrutinib)是我国第一个自主研发并拥有自主知识产权的抗肿瘤创新药,用于治疗套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和小淋巴细胞淋巴瘤,这为淋巴瘤患者的治疗提供更多选择[61]。但NRTK抑制剂作为抗肿瘤药物局限于血液系统恶性肿瘤的治疗,这使得开发治疗范围广、低毒、高效的NRTK抑制剂成为必然。

中药作为我国治疗肿瘤的特有手段,在肿瘤的预防、治疗和辅助治疗中发挥了其独特的优势,临床中多将中药与化疗药物联合使用,以达到协同增效的效果[62]。目前已报道多种中药单体可以靶向NRTK发挥抗肿瘤作用,作用机制包括:①直接与NRTK活性氨基酸残基结合抑制其磷酸化;②下调NRTK蛋白表达;③通过抑制其他上游信号通路,进而抑制NRTK的磷酸化激活;④促进NRTK蛋白降解;⑤与NRTK抑制剂联用,逆转癌症患者NRTK抑制剂的耐药性。本综述总结了近年来通过不同机制作用于NRTK的中药单体成分,从中可发现虽然中药单体在抑制NRTK方面已有众多研究结果,但目前中药单体的研究主要集中在体外细胞实验,体外动物研究与临床研究并不完善(表1)。此外,NRTK是一个庞大的家族,多种成员间也存在着复杂、紧密的联系,而研究者只是就中药单体对肿瘤中某一通路的作用机制进行研究,未能明确不同靶点间的交互作用,更不能体现中药多靶点的优势。

表1 调控NRTK的中药单体汇总

因此,后续研究应综合考虑中医药理论的辨证论治体系,深入探索中药单体激活NRTK具体作用机制,进行中药多靶点、多途径的研究,并对中药单体药动学特征、毒理学、生物利用度进行研究补充;同时应积极推进中药的临床研究,重视科研成果与临床应用的转化,为靶向NRTK的抗肿瘤中药单体走向临床提供理论依据。

续表1 调控NRTK的中药单体汇总