基于数据分析及生物膜干涉探讨中医治疗糖尿病肾病的用药规律*

张圆琳,祁晓鸣,冯逸佳,卫紫琪,宋丽娟

(1.山西中医药大学中药与食品工程学院,晋中 030619;2.山西中医药大学基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室,晋中 030619;3.国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室,晋中 030619)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最严重的并发症,也是导致糖尿病患者死亡的主要原因[1-2]。目前,临床主要通过降压、降糖的方式控制DN进展,尚无针对DN的特异治疗方法[3]。中医在辨证论治的基础上,开发了多种防治DN的中药复方及制剂[4-7],参芪地黄降糖颗粒、金水宝胶囊、益肾健脾汤等已被临床广泛使用并且取得了良好的治疗效果。但是,中药成分复杂,物质基础和作用机制尚不明确,阻碍了中医药现代化的研究进程。数据挖掘[8-9]为系统地认识中医药治疗疾病的组方规律、指导处方加减化裁、拟定新方提供了合理的解决办法。网络药理学[10]为分析中药治疗DN的物质基础及作用机制开辟了新方向。生物膜干涉[11]已被广泛应用于中药物质基础的研究中,为验证中药活性成分与DN核心蛋白的相互作用提供了实验依据。本研究以古今医案云平台DN专病医案库为基础,利用数据挖掘、网络药理学及生物膜干涉的方法,探索中医治疗DN的用药规律,发现核心药对组合及其治疗DN的作用机制,为临床合理选用DN治疗药物提供新思路及新方法。

1 材料与方法

1.1材料 ForteBio Octet K2生物膜干涉仪(FortiBio公司),异鼠李素、槲皮素(含量>98%,成都曼思特公司),人重组白细胞介素(interleukin,IL)6蛋白(Sino Biological公司)。

1.2数据来源与分析 “古今医案云平台”由中国中医科学院中医药信息研究所大健康智能研发中心设计研发,该平台收录医案数据40余万条,兼具医案检索与分析挖掘功能,是总结中医药经验的重要工具。在该平台的专病医案库中选择疾病种类为DN,并进行严格筛选:西医诊断明确为DN,不伴随其他并发疾病,仅使用中药治疗,且中药处方组成完整。利用平台的数据挖掘功能,对病案中涉及的中药进行频次统计及药物关联分析。

1.3化学成分靶点筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP),对核心药对化学成分及相应靶点进行筛选,参数[10]设为:口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及类药性(drug like,DL)≥0.18。

1.4DN靶点筛选 以“Diabetic Nephropathy”及“Diabetic Kidney Disease”为关键词在TTD、DISGENET及GENE CARD数据库收集疾病靶基因并进行整合。在OmicShare平台绘制DN靶基因与药物靶基因韦恩图,取交集得到核心药对治疗DN的潜在靶点。

1.5核心药对治疗DN蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI )网络及化学成分-靶点-疾病网络构建 在STRING网站构建蛋白互作网络,选择物种为Homo sapiens,交互作用可信度(combined score)阈值≥0.7,其余参数为默认值。运用Cytoscape 3.7.1版软件将蛋白互作网络可视化,获得PPI网络中前10的关键基因,其中,节点大小、颜色深浅与度值正相关,作为关键靶点的筛选依据,同时构建化学成分-靶点-疾病网络图。

1.6基因功能和通路富集分析 利用生物学信息注释数据库(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID),设置P<0.05为筛选条件,对筛选到的靶点进行GO生物学功能和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)富集分析。

1.7黄芪-丹参-茯苓药对化学成分与关键靶点分子对接 利用Sybyl-2.1软件的SurFlex-Dock(SFXC)模块对该药对中的化学成分与关键靶点进行分子对接研究。小分子优化选用Tripos力场,电荷类型为Gasteiger-Huckel,Gradient设为0.005,Max Iteration设为1 000次。蛋白做残基修饰,加氢,Amber7 FF99力场下加AMBER电荷,生成口袋,进行柔性对接。

1.8生物膜干涉实验 使用Octet K2生物分子互作仪,检测异鼠李素、槲皮素与IL-6的结合。将人重组IL-6蛋白包被于超级链霉亲和素(super streptavidin,SSA)传感器,浸没于不同浓度的化合物溶液中,结合、解离时间均为60 s。采用Data Analysis 11版软件对数据进行收集与分析。

2 结果

2.1中药使用频次统计 筛选出2008—2018年间101例患者的医案183条。涉及中药333味,总用药频次1 050次。使用频次居前10位的中药及其用量见表1。在183条医案所记载方剂中,黄芪出现43次,为使用频次最高的一味中药,而且方中重用黄芪,平均使用剂量为37 g,最大使用剂量达到了60 g;丹参与茯苓次之,使用频次均为36次,平均使用剂量分别为23、21 g,最大使用剂量也分别达到了30、45 g。

表1 治疗DN的中药使用频次(前10位)及剂量

2.2药物关联规则分析 置信度反映了前一种中药出现时,后一种中药也出现的概率;提升度则表明两药之间的相关性,提升度>1表明正相关性越高,提升度<1且越低则表明负相关性越高,提升度=1则表明无相关性。在置信度≥0.60,且提升度≥1.00的条件下,得到药物关联分析结果(表2)。对183条医案所记载方剂中的中药进行组方规律分析,方药中以黄芪(单独出现43次)为基础,同时配伍茯苓、丹参的频次分别为28次与25次,是组方中与黄芪配伍最多的2味中药。在此基础上,进一步分析了黄芪-丹参-茯苓同时出现的频次为19次,具有最高的置信度与提升度。因此,选择这3味中药作为临床治疗DN的常用药对,并利用网络药理学的方法对其作用机制进行研究。

表2 高频中药关联分析

2.3黄芪-丹参-茯苓化学成分筛选 筛选到化学成分共计100个,黄芪20个,丹参65个,茯苓15个,多为三萜类、酚酸类、黄酮类及甾体类化合物。部分化合物信息见表3。

表3 黄芪-丹参-茯苓中的成分

2.4黄芪-丹参-茯苓治疗DN潜在靶点预测 使用TCMSP数据库检索到100个化学成分对应的144个靶点,与TTD、DISGENET及GeneCards数据库中的DN疾病靶点取交集,发现共同靶点89个(图1),即为黄芪-丹参-茯苓治疗DN的潜在靶点。

图1 黄芪-丹参-茯苓靶点与DN靶点韦恩图

2.5黄芪-丹参-茯苓治疗DN PPI网络及成分-靶点-疾病网络结果分析 将“2.4节”中89个药物-疾病共同靶点作PPI网络图(图2),共包含79个节点,337条边,平均节点度为8.53。选取节点度值大于2倍度值均数的蛋白作为黄芪-丹参-茯苓防治DN的关键靶蛋白。其中排名前10的靶点是IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)8、MAPK1、JUN、TP53、IL-1β、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和前列素内环氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2),为该药对治疗DN的核心靶点。药对-化学成分-靶点-疾病网络图展示了100个化合物与89个靶点的作用情况(图3)。绿色圆形代表黄芪、丹参、茯苓3种中药,粉色圆形、亮绿色圆形及黄色圆形代表3种中药对应的化学成分,棕色圆形代表黄芪与茯苓的共有成分,蓝色圆形代表疾病,红色圆形代表靶点。在网络中,化合物作用的靶点数越多,度值越高,据此列出了前10个化学成分,括号里为度值:槲皮素(57)、山奈酚(29)、木犀草素(26)、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇(25)、刺芒柄花素(23)、异鼠李素(22)、丹参新醌(21)、二氢丹参内酯(18)、鼠尾草酚酮(17)、丹参酮ⅡA(16)。由此可见,同一种成分可以与多个靶点对应,同一个靶点亦可以与多种成分对应,说明药材中多种成分可通过作用于多个靶点发挥协同治疗作用,体现了中药多成分、多靶点的特点。

2.6KEGG富集分析 KEGG富集分析结果根据P值列出前15条通路,并绘制高级气泡图(图4)。其中包括肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signalingpathway)等。与药物成分、靶点相关程度最高的通路为TNF炎症信号通路,共富集到9个基因。其中,IL-6与TNF-α位于TNF炎症信号通路最下游,是该通路激活后释放的关键促炎因子。提示TNF炎症信号通路和靶点可能是黄芪-丹参-茯苓组分抗DN的核心途径和潜在作用靶点。

图4 核心靶基因KEGG富集分析气泡图

2.7黄芪-丹参-茯苓药对化学成分与关键靶点分子对接结果 将“2.5节”中列出的10个化合物与IL-6(PDB ID 4cni)、TNF(PDB ID 2az5)及VEGFA(PDB ID 4kzn)进行分子对接研究,按照Total Score得分高低进行排序(表4),Total Score≥5即认为化合物与靶点有较好结合,对接得分值>7提示具有强烈的结合作用[12]。化合物与关键靶点IL-6的时按得分均>5,其中7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、异鼠李素、槲皮素和丹参酮ⅡA与IL-6的对接得分均>7,具有强烈的结合活性。因此,选取这4个化合物与IL-6进行体外实验验证。

表4 活性成分与靶蛋白的分子对接

2.8异鼠李素、槲皮素与IL-6的结合作用 生物膜干涉实验结果表明,在10～100 μmol·L-1浓度区间,异鼠李素、槲皮素与IL-6有较强的结合作用力,解离常数(KD)分别为56与68 μmol·L-1,这与分子对接的结果基本吻合,并且呈现出迅速结合,迅速解离的趋势(图5)。尽管7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇与IL-6具有最高的得分,但是化合物难以获得;丹参酮ⅡA与SSA传感器存在强烈的非特异性结合,导致拟合数据异常。因此,实验中仅检测了异鼠李素、槲皮素与IL-6的结合作用。

图5 活性成分(异鼠李素和槲皮素)与IL-6的结合解离图

3 讨论

本研究利用数据挖掘技术对古今医案云平台DN专病医案库进行用药规律分析。共纳入有效方剂183条,涉及中药333味。发现临床治疗DN使用次数最多的是黄芪(43次)、其次是丹参(36次)、茯苓(36次)、山药(23次)、泽泻(21次)等。方中重用黄芪,以加强补气之功效;丹参活血祛瘀;茯苓兼具补气与利水之功效,符合中医治疗DN的原则。以黄芪为基础,通过对不同药物进行关联分析,发现“黄芪-丹参-茯苓”为治疗DN的最基本组合。

通过网络药理学的方法分析了“黄芪-丹参-茯苓”治疗DN的作用机制。成分靶点与疾病靶点取交集后,发现了共同靶点89个。对它们进行PPI网络分析,筛选到节点度值>2倍平均度值的核心靶点10个,依次为IL-6、TNF、VEGFA、MAPK8、MAPK1、JUN、TP53、IL-1β、EGF和PTGS2。KEGG富集分析发现的关键信号通路包括TNF炎症信号通路、MAPK信号通路、NOD样受体信号通路以及Toll样受体信号通路,它们在调节肾脏疾病的炎症反应中起重要作用[13-14],而炎症是DN发生与发展的重要病理因素[15]。TNF炎症信号通路共富集到基因9个,包括IL-6、TNF-α及IL-1β等核心靶点,这些促炎因子均位于TNF炎症信号通路最下游,激活后会加重炎症反应,涉及DN的各个阶段。研究发现,IL-6作为一种促炎因子,通过与IL-6受体或其他蛋白质形成复合物,激活下游的免疫、炎症反应,损伤肾小球、系膜细胞、足细胞等肾脏细胞,使肾小球基底膜增厚,出现蛋白尿,诱发、加剧DN[16]。研究表明,重组的抗IL-6受体融合蛋白[17]通过阻断IL-6受体,抑制了IL-6信号通路下游的免疫、炎症反应,从而对DN起到了一定的治疗作用。这也提示,通过靶向IL-6,而不是IL-6受体来阻断IL-6信号通路引起的炎症反应,可能是未来治疗DN的一种新选择。

通过研究中药活性成分与靶蛋白的相互作用,有利于阐明中药药理作用机制。分子对接技术与生物膜干涉技术可分别在虚拟筛选及体外实验水平分析药物分子与靶蛋白之间的相互作用。生物膜干涉技术[18]可以实时检测蛋白质与药物小分子的相互作用情况,广泛应用于中药活性成分发现与作用机制研究。通过测定动力学常数,可以反映药物小分子与蛋白质间的结合情况。解离常数(KD)值可反映小分子与靶蛋白的结合强度,结合速率常数(association rate constant,Kon)与解离速率常数(dissociation rate constant,Koff)可反映小分子与靶蛋白的作用特点。实验结果表明,异鼠李素和槲皮素与IL-6的对接得分值>7,具有强烈的结合作用。生物膜干涉实验也证实2种成分与IL-6具有较强的结合作用力,并且呈现出迅速结合,迅速解离的趋势,预示上述2种成分具有抑制IL-6信号通路、减轻炎症反应的潜力。

因此,TNF炎症信号通路和IL-6可能是“黄芪-丹参-茯苓”治疗DN的核心途径和潜在作用靶点。本研究筛选到的槲皮素[19]、山奈酚[20]及木犀草素[21]已被证实对DN具有治疗作用,但是作用机制尚不明确,特别是针对IL-6信号通路的研究较少。后续研究中仍需扩大分析样本,联合使用多种实验技术手段,在细胞及动物水平观察核心成分对IL-6信号通路以及细胞生物功能的调节作用。