香砂养胃丸气相色谱指纹图谱及多成分的含量测定*

毛颐晴,仝立卿,朱颖,张庆,刘雯婷,曹玉

(南京市食品药品监督检验院,南京 211198)

香砂养胃丸为国家基本药物,始载于明代《万病回春》,由木香、砂仁、陈皮、枳实、厚朴、香附等14味药材制成,具有温中和胃之功效,临床上广泛用于胃阳不足、湿阻气滞所致的胃痛[1]。其中白术、木香、砂仁为君药;豆蔻、藿香、陈皮、厚朴、香附为臣药;茯苓、枳实、半夏为佐药[2]。

香砂养胃丸现有水丸、浓缩丸、大蜜丸3种剂型,水丸、浓缩丸收载于《中华人民共和国药典》2020年版一部,部分厂家的大蜜丸制剂遵循国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-11014(ZD-1014)-2002-2011Z。现行标准以显微、薄层鉴别及橙皮苷、厚朴酚与和厚朴酚的含量作为质量评价方法[1],文献报道多集中在非挥发性成分的高效液相色谱指纹图谱研究[3-4]和木香、砂仁、枳实单味药所含成分的定量研究[5-7]。

方中木香、砂仁、豆蔻、广藿香、香附等均含有挥发性成分;砂仁、豆蔻挥发油中含桉油精、乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑和柠檬烯等;砂仁中乙酸龙脑酯含量较高;豆蔻中桉油精含量较高,具抗菌抑菌、镇痛消炎活性和保护胃黏膜的功能[8-10]。柠檬烯也是陈皮、枳实挥发油的主要成分[11-12]。广藿香挥发油的主要成分百秋李醇和广藿香酮具有抗菌、抗炎、免疫调节活性[13]。香附挥发油的主要药效成分α-香附酮可通过破坏脑内微管纤维而减轻炎症[14]。中药指纹图谱能综合反映和控制制剂整体质量[15-20],故而建立气相色谱(gas chromatography,GC)指纹图谱,同时根据“君、臣、佐、使”中医配伍理论,结合中药质量标志物[21]的确认原则,选定上述柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮和α-香附酮等8种成分为目标,进行定量研究,旨在对香砂养胃丸中挥发性成分进行全面评价,为质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 8890A 气相色谱仪(美国Agilent公司),FID(Flame Ionization Detector)检测器;XSE205、XPE26 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,感量:0.01、0.001 mg);色谱柱:DB-624 毛细管色谱柱(30 mm×0.25 mm,1.40 μm,美国Agilent公司)。

1.2试药 环己烷为分析纯,水为纯化水。柠檬烯(批号:100470-201503,含量:96.0%)、桉油精(批号:110788-202108,含量:99.4%)、樟脑(批号:110747-202011,含量:98.8%)、龙脑(批号:110881-201709,含量:99.6%)、乙酸龙脑酯(批号:110759-202007,含量:99.3%)、百秋李醇(批号:110772-201909,含量:100.0%)、广藿香酮(批号:111822-201904)、α-香附酮(批号:110748-202117,含量:99.8%)、芳樟醇(批号:111503-202004,含量:98.8%)、β-榄香烯(批号:100268-201903,含量:99.4%)、木香烃内酯(批号:111524-201911,含量:99.9%)、去氢木香内酯(批号:111525-201912,含量:99.5%)对照品,均购自中国食品药品检定研究院;β-桉叶醇(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:10274,含量:95.0%),苍术酮(Panphy®Chemicals Corporation,批号:19A-TSG-50-5)。

样品:56批香砂养胃丸市售样品来源于45个厂家,包含水丸35个厂家共35批,浓缩丸11个厂家共19批,大蜜丸2个厂家共2批,见表1。

表1 香砂养胃丸大蜜丸、浓缩丸、水丸样品信息

2 方法与结果

2.1色谱柱的选择及提取方法的考察 由于待测成分较多,且包括部分未知成分,分别选用DB-1、HP-5、DB-624不同极性的色谱柱进行实验,结果以DB-624毛细管柱的色谱结果最为理想。

挥发性成分的提取方式一般包括挥发油提取法和脂溶性溶剂直接提取法,以环己烷为溶剂考察了直接超声提取和挥发油提取2种方式,结果选用挥发油提取法对样品进行提取,可以达到富集待测成分的目的。挥发油提取时间考察了60、120、180、300 min,结果表明180 min可以提取完全。

2.2色谱条件 DB-624毛细管柱(30 m×0.25 mm,1.40 μm);采用恒流模式,流速:1.5 mL·min-1,进样口温度:230 ℃;检测器温度:270 ℃;程序升温:初始温度60 ℃,以5 ℃·min-1的速率升温至160 ℃,保持10 min;再以3 ℃·min-1的升温速率升至200 ℃,保持5 min;以8 ℃·min-1,升温至260 ℃,保持5 min ;分流进样,分流比为10：1 。

2.3溶液的制备

2.3.1对照品溶液的制备 精密称取柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮对照品适量,加入环己烷,制成每毫升分别含0.286 1、0.490 4、0.322 9、0.188 0、0.307 8、0.515 6、0.398 9、0.497 3 mg的混合对照品溶液。另精密称取芳樟醇、β-榄香烯、苍术酮、β-桉叶醇、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量,加环己烷分别制成每毫升含0.200 1、0.145 4、0.061 60、0.187 3、0.040 15、0.063 20 mg的对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备 取本品水丸和浓缩丸,研细;大蜜丸剪碎,混匀。水丸、大蜜丸取约9 g,浓缩丸取约5 g,按挥发油提取法,自挥发油提取器上端加入环己烷2 mL,加热提取3 h,分取环己烷液,用无水硫酸钠脱水,置5 mL量瓶中,用少量环己烷洗涤无水硫酸钠,合并环己烷液置5 mL量瓶,加环己烷稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3.3单味药材溶液的制备 取砂仁、豆蔻、广藿香、香附、陈皮、枳实、半夏、白术、厚朴、木香、生姜共11味药材各1 g,按“2.3.2节”方法制备单味药材溶液。

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验 取同一份供试品溶液(C1),按“2.2节”色谱条件连续进样6次,以乙酸龙脑酯峰为参照峰,计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD),结果相对峰面积<5.0%,相对保留时间RSD<1.0%,图谱相互间相似度均>0.95,表明仪器精密度良好。

2.4.2稳定性实验 取同一份供试品溶液(C1),分别于0、 4、 8、12、24、48 h按“2.2节”色谱条件测定,以乙酸龙脑酯峰为参照峰,计算各共有峰的相对峰面积、相对保留时间的RSD值,结果相对峰面积<5.0%,相对保留时间RSD<1.0%,图谱相互间相似度均>0.95,表明该方法重复性良好。

2.4.3重复性实验 取香砂养胃丸样品(C1)6份,各9 g,按“2.3.2节”处理,按“2.2节”测定,以乙酸龙脑酯峰为参照峰,计算各共有峰的相对峰面积、相对保留时间的RSD值,结果相对峰面积,相对保留时间RSD<1.0%,图谱相互间相似度均>0.95,表明该方法重复性良好。

2.5指纹图谱的质量评价

2.5.1对照指纹图谱的建立及共有峰的标定 取香砂养胃丸样品56批,按“2.3.2节”制备供试品溶液并进样测定,记录5 min之后的色谱图,通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行分析,样品(C1)的色谱图设为参照图谱,选用中位数、多点校正和全谱峰匹配生成对照指纹图谱的方法,时间窗宽度设置为0.2,分别得到浓缩丸和水(大蜜)丸的对照指纹图谱,共标定28个色谱峰,见图1,2。

4.柠檬烯;5.桉油精;7.芳樟醇;8.樟脑;9.龙脑;11.乙酸龙脑酯;12.β-榄香烯;20.苍术酮;21.β-桉叶醇;22.百秋李醇;24.广藿香酮;25.α-香附酮;27.木香烃内酯;28.去氢木香内酯。

4.柠檬烯;5.桉油精;7.芳樟醇;8.樟脑;9.龙脑;11.乙酸龙脑酯;12.β-榄香烯;20.苍术酮;21.β-桉叶醇;22.百秋李醇;24.广藿香酮;25.α-香附酮;27.木香烃内酯;28.去氢木香内酯。

2.5.2色谱峰归属分析 取“2.3节”的各对照品溶液、供试品溶液和各单味药材溶液适量,按“2.2节”色谱条件分别进样测定,通过供试品色谱图与对照品比对,以色谱峰保留时间为依据,指认了色谱峰14个,分别为4号峰(柠檬烯)、5号峰(桉油精)、7号峰(芳樟醇)、8号峰(樟脑)、9号峰(龙脑)、11号峰(乙酸龙脑酯)、12号峰(β-榄香烯)、20号峰(苍术酮)、21号峰(β-桉叶醇)、22 号峰(百秋李醇)、24号峰(广藿香酮)、25号峰(α-香附酮)、27号峰(木香烃内酯)、28号峰(去氢木香内酯)。通过供试品色谱图与各单味药材的GC图谱比对,以色谱峰保留时间为依据,其中1、3、5、6号峰来源于生姜;2、5、7、8、9、10、11号峰来源于豆蔻;4号峰主要来源于陈皮、枳实;4、5、7、8、9、11号峰来源于砂仁;12、20、21号峰来源于白术;4、8、12、13、18、21、27、28号峰来源于木香;14、15、22、24号峰来源于广藿香;4、16、17、23、25号峰来源于香附;21、26号峰来源于厚朴;20号峰来源于半夏。其中11号峰(乙酸龙脑酯)分离度良好,色谱峰保留时间适中,峰面积较大,故以其作为参照峰(S)。

2.5.3相似度评价 将56批样品的GC指纹图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价。结果56批样品与对照指纹图谱的相似度结果0.33～0.99,不同剂型、不同生产企业相似度结果差异较大,部分企业产品相似度结果较低。见表2。35批次水丸中C5、C16、C22、C29,2批次大蜜丸中A1,19批次浓缩丸中B1、B2、B3、B5、B7、B8、B12、B13、B14、B16、B17、B19的相似度均<0.85,反映样品中挥发性成分质量控制不理想。相似度受原料质量、储藏、生产工艺的影响较大,其中B12批次中厚朴酚与和厚朴酚的总量超过法定检验标准限度的近40倍,指纹图谱中厚朴特征峰面积也大,可能因企业为弥补药材挥发油提取过程中定量成分的损失,采用增加药材投料量的方式;砂仁、豆蔻、陈皮、枳实的主要挥发性成分为各种烯类、醇类,沸点较低,生产过程中粉碎干燥工艺影响较大。B13、B14、B16、B17、C5、C16、C22、C29批次中砂仁、豆蔻、陈皮、枳实的特征峰面积过小或缺失,除投料原因外,制备工艺中可能存在灭菌干燥温度过高、时间过长的问题。12批次相似度结果偏低的浓缩丸中广藿香和香附的特征峰面积较小或缺失,可能还和浓缩丸中挥发油提取工艺有关。企业S10两批次样品B13、B14的相似度仅为0.33、0,34,多个挥发性药材的特征峰缺失,提示该企业应重视挥发性药材的质量和储藏条件,优化生产工艺。

表2 样品相似度结果

2.6含量测定

2.6.1系统适用性及专属性实验 取“2.3节”混合对照品溶液和供试品溶液,按“2.2节”色谱条件进样,记录色谱图,供试品的8个色谱峰均能达到基线分离。

按处方要求制备缺砂仁、豆蔻的阴性对照样品,缺砂仁、豆蔻、生姜的阴性对照样品,缺广藿香的阴性对照样品,缺香附的阴性对照样品,按 “2.3.2节”制备阴性样品溶液。取阴性样品溶液及空白溶剂,按“2.2节”色谱条件进样注入气相色谱仪,测定。结果表明:阴性样品溶液中的其他成分对樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、桉油精、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮的测定无干扰,说明该色谱系统专属性较好。香砂养胃丸处方中陈皮、枳实、砂仁、豆蔻、厚朴等多味药均含柠檬烯,故未制备阴性对照样品。

2.6.2线性关系考察 分别精密量取上述混合对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL,加环己烷稀释至1 mL,摇匀,依“2.6.1节”测定,以进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。8个成分的线性范围、回归方程和相关系数见表3。

表3 8种成分的线性方程

2.6.3精密度实验 取“2.3.1节”混合对照品溶液适量,按“2.2节”色谱条件测定,记录峰面积,结果柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮的峰面积RSD分别为1.66%、1.66%、1.68%、1.72%、1.48%、1.67%、1.80%、1.71%,表明仪器精密度良好。

2.6.4稳定性实验 取同一批次供试品溶液(C1)分别于制备后0、4、8、12、24 h,按“2.2节”色谱条件测定,记录峰面积,结果柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮的峰面积RSD分别为0.54%、0.94%、1.01%、2.05%、0.85%、0.98%、1.20%、1.21%,表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.6.5重复性实验 取同一批次供试品(C1)按“2.3.2节”方法处理6份,按“2.2节”色谱条件测定,计算柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮的含量,结果含量的RSD分别为1.72%、2.24%、1.57%、1.99%、1.72%、1.60%、1.60%、1.62%,表明该方法重复性良好。

2.6.6回收率实验 取已知含量的样品(C1)约9 g,共6份,分别加入一定质量浓度的柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮对照品溶液适量,按“2.3.2节”方法处理,依“2.2节”色谱条件测定,计算柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮的平均回收率,分别为101.20%、97.90%、93.97%、94.23%、102.94%、100.54%、99.16%、98.31%;RSD分别为2.41%、1.48%、1.65%、2.00%、1.93%、2.30%、2.07%、2.38%。

2.756批样品含量测定 取56批次样品,按“2.3.2节”方法处理,依“2.2节”色谱条件测定,计算各成分含量,结果柠檬烯、桉油精、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、百秋李醇、广藿香酮、α-香附酮质量浓度分别为0.2～959.1、0.3～420.4、1.0～542.6、0.0～64.5、0.0～364.2、0.0～339.6、0.0～130.7、0.0～82.0 μg·g-1。相似度结果低于0.85的17批次样品测定结果见表4。

表4 17批次样品含量测定结果

在上述8种测定成分中,《中华人民共和国药典》2020年版只对豆蔻中桉油精、砂仁中乙酸龙脑酯、广藿香中百秋李醇进行了限定,要求含量不得低于3.0%、0.90%、0.10%[1] ,根据各药味在不同剂型中的处方量,计算56批样品桉油精、乙酸龙脑酯、百秋李醇的实际转移率。结果桉油精平均转移率为2.2%,乙酸龙脑酯平均转移率为8.3%,百秋李醇平均转移率为113.1%。56批次样品中桉油精转移率均低于20%,52批次乙酸龙脑酯转移率低于20%,含量均处于较低水平。百秋李醇转移率14批次低于20%,27批次高于100%,批次间含量差异较大。其他5个成分的含量也存在显著性差异。

3 讨论

将水丸、大蜜丸的指纹图谱和含量测定结果与浓缩丸进行比较,发现浓缩丸的相似度低于水丸、大蜜丸,这可能与生产工艺不同有关。3种剂型中砂仁、豆蔻的特征峰乙酸龙脑酯和桉油精的含量均处于较低水平,但浓缩丸高于水丸、大蜜丸。砂仁、豆蔻为果实类药材,乙酸龙脑酯和桉油精主要存在于种子团中,其粉碎程度越高,粉末放置时间越长,挥发油含量越低[22]。水丸、大蜜丸均为药材原粉入药,浓缩丸中仅砂仁、豆蔻、部分半夏和木香为原粉入药,而现行企业粉碎工艺中,都是药材总混后进行粉碎,水丸、大蜜丸需要打粉的药材更多造成粉碎时间更长,粉碎时药材温度过高,导致挥发性成分损失更多。浓缩丸中广藿香、香附、厚朴等特征峰强度明显低于水丸、大蜜丸,因在浓缩丸工艺中这些药材为提取挥发油后,药渣煎煮制成稠膏,挥发油未采用包合,直接和稠膏、细粉混匀入药,挥发油提取与混匀过程中可能造成有效成分的丢失,另外现行质量标准中水丸、大蜜丸有α-香附酮的薄层鉴别而浓缩丸没有,企业往往忽视对挥发性有效成分的控制。

同一剂型中,不同企业样品相似度及含量测定的结果差异较大,表明各企业从选材到生产工艺控制都存在差别。水丸中百秋李醇的转移率39.9%～485.1%,浓缩丸百秋李醇的转移率从未检出至57.4%,即使同一剂型差异也很显著。百秋李醇含量和广藿香药材叶的比例呈正相关[16],不同茎叶比例的广藿香药材投料是造成制剂中百秋李醇的含量差异显著原因之一。35批次水丸转移率高于100%有25批次,表明现行广藿香标准中百秋李醇的限度可能较低。未检测到百秋李醇的厂家存在减量投料或次品投料或制备工艺不严谨的问题。

挥发油易受外界的影响,指纹图谱及含量测定结果表明挥发性成分在香砂养胃丸中的控制并不理想,传统生产工艺有待改善。生产工艺中企业可对粉碎至投料的间隔时间予以控制;摸索合理的药材灭菌方式、制剂干燥的温度时间;砂仁、豆蔻采用几乎不产热的万能粉碎机单独打粉,再和其他药材粉末混和;浓缩丸提取的挥发油采用包合的方式,以保证挥发油类物质在香砂养胃丸中的量值传递。

本研究建立了香砂养胃丸的GC指纹图谱,同时对8种挥发性成分进行含量测定,为香砂养胃丸挥发性成分的鉴别和质量控制提供了可靠的技术支持,能更加全面地对香砂养胃丸的质量进行评价。