PTBP3对食管鳞状细胞癌细胞增殖与迁移的影响及机制研究

吕莹 郝明硕 钱阳 王蕊 相龙全

1济宁医学院临床医学院，济宁 272067；2济宁市第一人民医院病理科，济宁 272002

食管癌是全球最常见恶性肿瘤，尤其在亚洲一些地区，其发病率和病死率均居高不下。食管鳞状细胞癌（ESCC）占食管癌的90%，随着手术、放疗、化疗等多种治疗手段的发展，5年生存率不足20%［1-2］。ESCC早期症状不明显，疾病进展迅速，大多数患者在诊断时已进入晚期，治疗效果差。多嘧啶束结合蛋白3（PTBP3）属于RNA结合蛋白PTB家族，与多种肿瘤发生过程密切相关，包括RNA的剪接、稳定和转运等。既往研究发现，PTBP3在肺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌中蛋白水平升高［3-4］。本研究探讨PTBP3在ESCC中的表达情况及其作用机制，为ESCC的诊断及治疗提供新思路和方法。

材料与方法

1.细胞培养和转染

本研究使用的人ESCC细胞株有ECA109（北纳生物）、KYSE150（诺普赛生物）、KYSE30（上海中乔新舟生物科技有限公司）。细胞培养于含有10%胎牛血清（FBS，Gibco Australia）的RPMI 1640培养基（Gibco Australia）中，在37 ℃的5% CO2加湿培养箱中培养。转染小干扰siRNA时，将细胞接种于6孔板中，24 h后细胞密度40%～60%时用riboFECTTMCP转染试剂（Ribobio）转染miRNA mimic（Ribobio）。

2.组织样本

收集2021年1月至2023年5月济宁市第一人民医院的6例ESCC标本及其癌旁正常组织标本。所有患者均经病理诊断，手术切除前均未接受化疗或放疗。ESCC组织标本均通过组织病理学检查确定肿瘤大小、组织学分级、TNM分期和淋巴结转移情况。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求，所有患者均签署知情同意书。

3.慢病毒感染

感染前24 h将细胞接种于6孔板，按照感染倍数加入PTBP3 shRNA的慢病毒。转染72 h后用2 mg/L嘌呤霉素处理，选择稳定的细胞系。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blotting）检测PTBP3的转染效率。

4.Western blotting

细胞在含有1%磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解，并用BCA Protein Assay Kit（Beyotime）测定蛋白浓度。使用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将膜置于5%脱脂牛奶中，在旋转摇床上放置1 h，阻断非特异性结合位点，然后与一抗特异性抗体在4 ℃下孵育过夜。用1× TBST缓冲液洗涤3次（10 min/次）后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1 h。再次洗涤后，使用电化学发光（ECL）检测试剂（Beyotime）进行免疫印迹分析。

5.qRT-PCR

用TRIZOL（Invitrogen，USA）提取RNA，用SupersmartTM6 min耐热首链cDNA合成试剂盒（中实基因科技有限公司）合成cDNA。采用Ribo mRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒（Ribobio）进行实时PCR。U6、miR29a-3p、miR29b-3p及miR29c-3p引物购自锐博生物，使用miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒（Ribobio）进行实时PCR，其余用于RT-PCR分析引物如下：GAPDH Forward Primer：GAACGGGAAGCTCACTGG；GAPDH Reverse Primer：GCCTGCTTCACCACCTTCT；PTBP3 Forward Primer：TGTCCCACCAACTATTCATCCA；PTBP3 Reverse Primer：CTCTGGAACATATGCCTCAGGT。

6.细胞计数试剂盒（CCK-8）

CCK-8（Dojindo，日本）检测细胞增殖。将慢病毒感染24 h的肿瘤细胞以每孔1 000个细胞密度接种到96孔细胞培养板中，体积为100 µl，在正常条件下培养24 h，然后每孔加入10 µl CCK-8试剂，2 h后，使用酶标仪在450 nm处测量吸光度值。每组试验重复3次。

7.细胞划痕试验

将细胞接种到6孔板上，孵育24 h后，用100 µl无菌吸管尖划伤融合细胞单层，加入无血清培养基。0 h、24 h和48 h倒置显微镜测量划痕间隙距离，显微镜拍摄图片经Image J软件计算细胞迁移距离。

8.生信数据分析

使用UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/）、癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析食管癌组织及正常食管组织PTBP3的表达差异及PTBP3与miR29家族的关系。

9.统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.ESCC组织中PTBP3基因表达水平

利用TCGA数据研究ESCC组织和正常食管组织PTBP3的表达水平，结果显示，ESCC组织中PTBP3基因的表达量高于正常食管组织（P＜0.001），且与食管腺癌及正常食管组织相比，ESCC组织中的PTBP3表达水平较高（P＜0.05）。PTBP3表达水平和临床分期、病理分化程度以及淋巴结转移程度关系不明显（图1A～D）。正常食管鳞状上皮组织以及ESCC组织中PTBP3蛋白和mRNA的表达水平，结果表明，与正常食管鳞状上皮组织相比，PTBP3在ESCC组织中高表达，与TCGA数据库中数据一致（图1E～G）。

图1 PTBP3在ESCC组织中高表达。A为TCGA数据库中PTBP3在食管癌与正常食管组织中的表达差异，B为TCGA数据库中PTBP3基因表达与临床分期的关系，C为TCGA数据库中PTBP3基因表达与肿瘤分化程度的关系，D为TCGA数据库中淋巴结转移与PTBP3基因表达关系，E为qRT-PCR检测ESCC和食管鳞状上皮组织中PTBP3 mRNA的表达情况，F、G为Western blotting检测ESCC和食管鳞状上皮组织中的PTBP3蛋白表达水平

2.PTBP3敲低抑制ESCC细胞株迁移和增殖

慢病毒感染构建PTBP3稳定敲低的ESCC细胞，qRT-PCR和Western blotting结果显示，ECA109细胞、KYSE150细胞、KYSE30细胞中PTBP3 mRNA和蛋白水平降低（图2A～C）。CCK-8试验结果显示，敲低PTBP3能抑制ECA109细胞、KYSE150细胞及KYSE30细胞增殖能力（图2D）。细胞划痕试验结果显示，PTBP3敲低能抑制ESCC细胞迁移能力（图2E～F）。

图2 感染PTBP3敲低病毒能降低ESCC细胞活力和迁移能力。A、B为Western blotting检测细胞中PTBP3蛋白表达情况，C为qRT-PCR检测细胞中PTBP3 mRNA表达情况，D为CCK-8试验检测ESCC细胞活力，E、F为细胞划痕试验检测ESCC细胞的迁移能力

3.PTBP3敲低可降低ESCC细胞miR-29a-3p与miR-29c-3p的表达水平

PTBP3在miRNA前体转录过程中发挥作用。通过TCGA数据库筛选PTBP3潜在的下游靶点分子，结果发现，在食管癌组织中，PTBP3基因表达与hsa-miR29-3p的表达相关。qRT-PCR结果表明，与对照病毒组相比，3种ESCC细胞（KYSE30、ECA109、KYSE150）的PTBP3敲低组中miR-29a-3p与miR-29c-3p表达水平下调（t=29.007、7.057、4.844、12.625、15.612、18.861，均P＜0.05），而miR-29b-3p的表达在KYSE30、ECA109细胞中差别较大（图3A～C）。

图3 PTBP3敲低可降低ESCC细胞中miR-29a-3p与miR-29c-3p的表达量。A～C为qRT-PCR检测ESCC细胞中miR-29家族表达情况

4.ESCC组织中miR-29与PTBP3的表达水平

qRT-PCR结果表明，与正常食管鳞状上皮组织相比，miR-29家族在ESCC组织中高表达（图4A～C）。ESCC组织中miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-29c-3p相对表达量与PTBP3相对表达量进行相关性分析，结果表明，ESCC组织中miR-29a-3p和miR-29c-3p表达量与PTBP3表达量相关。

图4 ESCC组织中miR-29家族表达升高，且与PTBP3表达相关。A～C为qRT-PCR检测ESCC组织中miR-29家族表达情况，D～F为ESCC组织中miR-29家族与PTBP3表达情况相关性

讨论

PTBP家族成员主要参与RNA剪接，可以在细胞质和细胞核之间穿梭，优先结合富含多嘧啶的RNA片段［5］。PTBP1和PTBP2的相关研究较多，而PTBP3的相关功能近年来才引起学者们的关注［6-8］。Yamamoto等［7］文献表明，PTBP3能够作为调节蛋白参与细胞分化。也有文献证实，PTBP3与多种恶性肿瘤进展密切相关，并且可能具有组织特异性，在肺癌、乳腺癌、胃癌中PTBP3蛋白水平升高，而胶质母细胞瘤中PTBP3表达水平低于周围正常组织［3，8-10］。PTBP3通过选择性剪接参与胃癌转移、分化和迁移，抑制PTBP3可诱导胃癌细胞凋亡及细胞周期阻滞，增强5-氟尿嘧啶对胃癌细胞的毒性［11-12］。另外，PTBP3能够通过调节缺氧诱导因子-1α翻译激活，维持UBE4A mRNA稳定性，从而调控P53表达，促进结直肠癌细胞增殖与迁移［4，13］。本研究证实PTBP3在ESCC患者中高表达，PTBP3表达可抑制ESCC细胞增殖和迁移。

Treiber等［14］研究提示，PTBP3对miR-29家族成员进行转录后调控，促进pre-miRNA剪接在miRNA成熟过程中发挥作用。miR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c组成，它们在基因序列和生物学功能上有很高的保守性。miR-29家族已被证明在多种癌症中起着重要作用，主要通过与靶基因3'非编码区域结合，抑制靶基因表达，发挥抑癌或促癌作用，如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路中的重要蛋白位点［15］。有研究发现，当miR-29被沉默时，食管癌细胞增殖能力降低，细胞周期被阻断在G1期，与食管癌进展和预后相关［16-17］。在miR-29家族中，miR-29-3p是主要发挥功能的片段，因此，选择miR-29-3p作为主要研究对象［18-19］。本研究结果表明，PTBP3敲低之后，ESCC细胞中miR-29a-3p与miR-29c-3p表达降低。miR-29b-3p的表达具有个体差异性，在KYSE30细胞中表达升高，ECA109 细胞中表达降低，KYSE150细胞中差异不明显，深层次的表达差异机制需要我们更进一步探索。此外，在ESCC组织中，我们发现PTBP3表达与miR-29家族成员表达均呈正相关性。因此，我们猜测PTBP3可以参与pre-miR-29家族成员的转录后调控，促进成熟miR-29形成，而其中的具体机制需要进一步研究。

本研究初步探讨PTBP3在ESCC细胞中的表达水平以及PTBP3在ESCC细胞增殖和迁移方面的功能作用，并且证明PTBP3可通过与前体miRNA结合调控miR-29家族表达，进而调节ESCC细胞活性和迁移。PTBP3是ESCC的一个重要分子标志物和潜在治疗靶点，可为ESCC早期诊断和治疗提供新思路和方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明吕莹：实施研究，采集、分析/解释数据，起草文章，对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析；郝明硕：酝酿和设计试验，实施研究，起草文章，指导，支持性贡献；钱阳：实施研究，采集、分析/解释数据，起草文章，统计分析；王蕊：实施研究，采集数据，起草文章，统计分析；相龙全：酝酿和设计试验，实施研究，对文章的知识性内容作批评性审阅，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献