2013—2022年某医院肺泡灌洗液病原菌分布及耐药性分析

许超 王笑尘 田磊

华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉 430000

呼吸道的感染大都是多种细菌共同作用的结果，有较高的致死率和发病率，临床上相关的诊断与治疗需要病原学的支持［1］。由于上呼吸道存在很多正常菌群的感染，这使得传统的痰培养很难得到临床需要的诊断结果［2］。而在支气管镜协助下直接从下呼吸道深部取得的肺泡灌洗液避免了口腔等部位定植菌的污染和干扰，致病菌占比往往较高，能更好地指导临床的诊断和治疗［3］。在全球范围内，细菌耐药性已经引起了广泛关注，细菌的获得性耐药往往与抗生素的过度使用有关［4］。若能首先明确病原菌，而后完善其药敏试验结果以进行精准治疗，能有效减少细菌耐药性的产生。本研究报道了华中科技大学同济医学院附属同济医院2013—2022年肺泡灌洗液中检出的主要病原菌及其耐药性。

材料与方法

1.菌株

收集2013年1月至2022年12月华中科技大学同济医学院附属同济医院肺泡灌洗液所培养出的病原菌。

2.菌株的鉴定和药敏实验

菌株鉴定采用质谱仪（型号：MALDI Biotyper，德国布鲁克公司，型号：AUTOF MS1000，安图公司），结合细菌自动鉴定系统（型号：VITEK-2 COMPACT，法国梅里埃公司）和吲哚实验、奥普托辛敏感实验进行综合判定。药敏实验采用纸片扩散法，肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）体外药敏实验采用血水解酪蛋白平皿，肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，KPN）、铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PAE）、鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumanii，ABA）和金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus， SAU）采用水解酪蛋白平皿。头孢他啶/阿维巴坦和多黏菌素B（Polymyxin B，PloyB）为BIO-KONT温州市康泰生物科技有限公司产品，其余测试药敏纸片、E试验条及培养基均为英国OXOID公司产品。药敏结果判断采用2023年CLSI M100标准，PloyB采用国内专家共识，替加环素采用美国食品药品监督管理局推荐的标准。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

3.质量控制

根据2023年CLSI M100标准选择标准菌株ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853、ATCC49619每周做1次室内质量控制，结果合格后开始检测分析临床分离病原菌的药敏试验。

4.分析方法

分离所得病原菌的分布及药敏结果的分析采用WHONET5.6版软件进行，对同一患者分离的相同病原菌，只对第1株菌做体外药敏分析。

结果

2013年1月至2022年12月共送检36 233例肺泡灌洗液标本，其中检出非重复病原菌11 801株，阳性率32.57%。包括革兰阴性菌8 231株，占比69.75%，革兰阳性菌1 378株，占比11.68%，真菌2 192株，占比18.57%。其中革兰阴性菌以KPN、PAE和ABA为主，且KPN在所有致病菌中占比最高，革兰阳性菌以SAU和SPN为主，真菌以白色念珠菌和烟曲霉为主，所有肺泡灌洗液病原菌的检出情况见表1。在所有检出致病菌的患者中，男性均多于女性，且呼吸科和心脏大血管外科占比最多，见表2。

表1 肺泡灌洗液标本的主要病原菌检出情况[株（%）]

表2 检出致病菌的患者分布情况[例（%）]

在肺泡灌洗液检出的革兰阴性菌中，KPN对哌拉西林，氨苄西林/舒巴坦，头孢唑啉，头孢呋辛，头孢噻肟和环丙沙星的耐药率均超过40.00%，对阿米卡星，亚胺培南、美罗培南和替加环素敏感性超过70.00%；PAE则对复方新诺明和米诺环素的耐药率超过50.00%，对其他常见抗生素的敏感性均超过40.00%；而ABA对除米诺环素外的所有抗生素耐药率均超过75.00%。具体耐药率和敏感率情况，见表3。

表3 主要革兰阴性菌对抗菌药物的耐药率（%）

在最主要的致病菌KPN中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant to klebsiella pneumoniae，CRKPN）的占比整体呈上升趋势，在2018年和2022年出现下降趋势，华中科技大学同济医学院附属同济医院在2020开始对检出的CRKPN加做头孢他啶/阿维巴坦和PloyB体外药敏实验后，发现耐药率在15.00%以下，但也出现了逐年上升的趋势，见表4。

表4 2013—2022年CRKPN占比及其加做药敏实验的耐药性

肺泡灌洗液中分离的SAU对万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁的敏感率均为100.0%。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）占52.20%，略高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-susceptible to staphylococcus aureus，MSSA），MRSA对除复方新诺明外的抗生素均相较于MSSA更加耐药，具体耐药率和敏感率情况，见表5。

表5 金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感率与耐药率（%）

肺泡灌洗液中分离的SPN对万古霉素和莫西沙星的敏感率均为100.0%，对红霉素和克林霉素的耐药率超过85.0%。其中，青霉素敏感肺炎链球菌（penicillin-susceptible to streptococcus pneumoniae，PSSP）占95.32%，远高于青霉素中介肺炎链球菌（penicillin-mediated Streptococcus pneumoniae，PISP）和青霉素耐药肺炎链球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP），具体耐药率和敏感率情况，见表6。

表6 肺炎链球菌对抗菌药物的敏感率与耐药率（%）

讨论

本研究显示，在2013—2022年，华中科技大学同济医学院附属同济医院送检的肺泡灌洗液培养结果中，致病菌以革兰阴性菌为主，且革兰阴性菌的占比呈逐年上升趋势，与杨青等［5］结果相同，真菌次之，革兰阳性菌占比最低。在革兰阴性菌中，KPN、PAE和ABA的占比较高，与全国耐药细菌监测网结果一致［6］。其中，KPN的占比在所有致病菌中最高，且呈整体上升趋势。在革兰阳性菌中以SAU和SPN占比较高，也与全国耐药细菌监测网结果一致［6］。其中，SAU占比每一年均为最高。在真菌中每一年占比最高的均为白色念珠菌。

在主要的革兰阴性致病菌中，KPN对青霉素类、第二代头孢、第三代头孢和喹诺酮类抗生素较为耐药，而对氨基糖苷类、碳青霉烯类和四环素类抗生素较为敏感。这可能与临床上长期大量使用第二代头孢、第三代头孢和喹诺酮类抗生素有关，长期使用可能造成耐药的产生。所以，临床上对于KPN可优先使用氨基糖胺类、碳青霉烯类和四环素类抗生素，以此节约治疗时间。PAE的耐药机制一般不是单个因素造成的，而是由多种机制相互协同的结果，耐药机制非常复杂［7］。同一种抗生素的长时间使用有可能导致其耐药情况的发生，对于PAE感染的患者应随时根据其临床症状以及药敏结果适当调整药物的使用，以此降低PAE产生耐药的概率。本研究中发现PAE第三代头孢、第四代头孢和氨基糖苷类抗生素均较为敏感，临床可以优先选择使用。PAE可以在环境中长期存在并且形成生物被膜，在临床工作中应严格执行接触隔离和环境消毒。ABA对所有抗生素耐药率均较高，相比之下米诺环素耐药率较低。本研究结果发现，ABA对亚胺培南（86.8%）和美罗培南（82.5%）的耐药率高于全国耐药监测网的水平（80.4%）［6］。ABA等非发酵菌可以在环境中长期存在并定殖，且耐药率高，在临床中需要更加关注操作的规范性及抗生素应用的合理性。针对抗ABA治疗，相关指南推荐舒巴坦复方制剂以及米诺环素等多种药物联合使用，或者以碳青霉烯类阿米卡星为基础联合替加环素和将PloyB作为基础用药的方案［8-9］。

在对CRPKN的逐年分析中发现CRKPN的占比越来越高，呈整体上升趋势，这可能与抗生素的大量使用有关［10］。在2017年和2021年，华中科技大学同济医学院附属同济医院发现CRKPN的占比较高时，分别于2018年对手术科室新入院患者进行CRE的筛查工作，并对筛查阳性患者进行隔离措施，于2022年加强了临床科室的卫生宣教和CRE的筛查力度。结果发现，在2018年和2022年CRKPN的占比明显下降，说明对CRE的筛查隔离工作和临床科室的卫生宣教能有效减少CRKPN的产生。在CRKPN的治疗中，由于一线抗生素使用的失败，CRKPN相关的细菌感染已经成为了威胁人类健康的重要因素［11-12］。《中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识》［13］建议对将头孢他啶/阿维巴坦作为CRKPN肺炎患者的首选治疗方案，国外也有专家推荐将头孢他啶/阿维巴坦作为碳青霉烯类抗生素的替代抗生素以及PloyB加替加环素作为CRKPN的一线治疗抗生素［14-15］。CRKPN的主要耐药机制是产碳青霉烯酶，有研究表明产肺炎克雷伯碳青霉烯酶和苯唑西林酶的KPN对头孢他啶/阿维巴坦敏感，而产新德里金属酶β-内酰胺酶的KPN对头孢他啶/阿维巴坦耐药［16-17］。PloyB由于肾毒性高，且有其他替代抗生素的存在，在上世纪70年代临床上就使用较少了［18］。近年来，由于多重耐药的广泛存在和新型抗生素的开发周期长两个因素，使得PloyB又重新被临床上使用，并成为了革兰阴性菌多重耐药的主要抗菌药物，有研究表明多黏菌素B的耐药机制与脂多糖的修饰有关［19-20］。在2020年开始，本院对CRKPN加做头孢他啶/阿维巴坦和PloyB的体外药敏试验，2020—2022年结果显示，CRKPN对头孢他啶/阿维巴坦和PloyB的耐药率均在15.0%以下，但这3年耐药率也呈上升趋势，表明临床须对此类更高级别抗生素的使用更加规范，以避免耐药性的增长。

本研究中未发现对万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁耐药的SAU，MRSA的占比高于MSSA的占比，MRSA对大部分抗生素的敏感性相较于MSSA更差，抗感染治疗难度更大。在对SAU的治疗方面，临床可以优先使用复方新诺明、替加环素、万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁。本研究中所有SPN对万古霉素和莫西沙星均敏感，且绝大多数为PSSP。SPN对红霉素和克林霉素敏感性较差，其中PSSP比PISP、PRSP对左氧氟沙星和头孢曲松的敏感性更好，抗感染治疗时的难度更小。在SPN的治疗中，可以尽量避免红霉素和克林霉素的使用。同时，由于PISP和PRSP的发现较少，对PISP和PRSP的结果报告应更加谨慎。

真菌常常寄生在人体皮肤表面或呼吸道黏膜处，多为条件致病菌，正常情况下不致病［21］。本次检出的真菌中较多的是白色念珠菌和烟曲霉。念珠菌常常与人共生，其感染引起的肺炎发生概率较低，烟曲霉在通过呼吸道入侵到人体时多能被呼吸道黏膜处的免疫细胞所识别并及时清除，烟曲霉致病多发生在免疫功能低下的患者［22-23］。临床上一般将在患者肺泡灌洗液中检出的念珠菌等真菌考虑为呼吸道定植菌，认为其并没有诊断意义，所以对于检出的真菌并未常规做药敏分析［24］。然而，从2020年以来，本院白色念珠菌和曲霉属真菌等真菌的检出较之前有较大增长，且近年来真菌感染及产生耐药的案例时有发生，故临床应提高对真菌感染的重视［25］。新型隐球菌是一种条件致病菌，可存在于人体表与肠道等处，致病时可引起下呼吸道或中枢神经系统感染，其在脑脊液检出时往往更具有临床意义［26］。本次研究肺泡灌洗液中共检出3例新型隐球菌感染，且患者均肺部症状不明显，故未作相关药敏分析。本研究存在一定的局限性，由于每年的收样数量并不一致，近几年的收样数量高于之前，故最后统计的结论并不能很准确地反映这十年的整体情况。

综上所述，华中科技大学同济医学院附属同济医院2013年1月至2022年12月送检的所有肺泡灌洗液中，检出病原菌主要为KPN、PAE、ABA和SAU等，以革兰阴性菌居多，且CRKPN的占比和耐药率呈逐年上升趋势。提示临床应合理应用药物，以防范更加广泛的耐药细菌产生。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明许超：研究设计与实施、数据采集与分析、文章撰写、对文章的知识性内容作批评性审阅；王笑尘：文章修改、研究设计、统计分析、对文章的知识性内容作批评性审阅；田磊：文章修改、研究设计和实施、指导