B/T淋巴细胞弱化因子在急性哮喘小鼠模型CD4+T淋巴细胞表达的研究

靳 钰，刘永安，臧远胜，修清玉

(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)

哮喘(asthma)是临床常见具有临床易感性的慢性呼吸道变态反应性疾病。接触过敏原后IgE增高，结合肥大细胞和嗜酸性粒细胞，触发迅速而强烈的气道炎症反应［1］。目前CD4+T细胞极化时Ⅰ型和Ⅱ型辅助性T细胞(Th1和Th2细胞)两者比例失调［2］成为研究哮喘发病的重点。CD4+T淋巴细胞通过“双信号”实现细胞活化:第一信号TCR-抗原肽-MHCⅡ和第二信号共刺激受体［3］。共刺激受体分为正向和负向刺激受体，协助第一信号影响细胞活化，维持免疫系统稳态。目前负向共刺激受体有CTLA-4、PD-1、BLTA、TIM-3 等［4］。CTLA-4 和 PD-1可负调控免疫及炎症反应［5-7］。新近发现同CTLA-4、PD-1结构相似的BLTA免疫球蛋白超家族成员，可结合HVEM配体的负向共刺激受体。Yee发现BLTA基因敲除小鼠特异性抗体应答增强［8］，Deppong研究发现卵蛋白致敏小鼠可见气道炎症细胞浸润持续时间延长［9］。负向刺激受体BTLA能够抑制免疫应答控制炎症，但BLTA在哮喘发病中作用机制未明。本实验观察急性哮喘模型中BTLA的表达特点及地塞米松对其表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 4～5周龄BALB/C6清洁级雌性小鼠18只，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海第二军医大学动物实验中心(SPF)。主要试剂:OVA(V级，Sigma公司)，Aluminum(Sigma公司)，小鼠IL-4和IFN-γELISA试剂盒(R＆D公司)，PF anti-mouse BLTA抗体(Biolegend)和 FITC anti-mouse CD4+抗体(Biolegend)，淋巴细胞分离液(达科为公司)。试验时间2013年1月18日。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及哮喘模型建立［10］按照随机数字表法分为对照组、急性哮喘模型组和地塞米松治疗组，致敏用含20μg卵蛋白(OVA，V级，美国Sigma公司)和2 mg AL(OH)3(Sigma公司)的0.2 ml生理盐水;对照组仅给0.2ml含2mg AL(OH)3的生理盐水，分别第1和8天腹腔注射(i.p.);第21天激发，将致敏小鼠放入雾化箱(自制)，用超声雾化器(中国江苏鱼跃牌，402AI)激发小鼠诱发哮喘，雾化OVA浓度为2.5%，30分钟，每天1次，连续3天;地塞米松组每次激发前30 min给予地塞米松(i.p.10 mg/kg);对照组为生理盐水雾化。

1.2.2 标本采集和处理末次雾化后48 h断颈处死小鼠75%乙醇浸泡，超净台中取脾脏;肺脏浸泡至4%中性福尔马林溶液，24 h后组织性石蜡包埋切片;眼球取血于1.5 ml冻存管中，4℃离心机2000 rpm，取血清，参照ELisa试剂盒说明检测血清IL-4和 IFN-γ。

1.2.3 CD4+T淋巴细胞BTLA检测 脾脏原代淋巴细胞制备 超净台中取脾脏放在覆盖已消毒的200目无菌尼龙网的6 cm培养皿，培养皿中放5 m l淋巴细胞分离液，10ml无菌注射器内活塞研磨脾脏2～3 min，收集培养皿中细胞;将培养皿中细胞转移至15 ml离心管中，上层覆盖500μl 1640培养基;室温800 g离心30 min后，吸出淋巴细胞，10 ml 1640培养基洗涤，250 g离心10 min，收集细胞，用贴壁法除去单核/巨噬细胞后，显微镜下细胞计数，调整细胞至5×106。标记细胞表面分子:淋巴细胞悬液200μl中加1μl PE标记鼠抗BTLA抗体(Biolegend)和1μl FITC标记鼠抗 CD4抗体(Biolegend)，4℃避光孵育1小时，2500 rpm离心5 min，500μl PBS洗涤2次。上述细胞制备完成后，流式细胞仪检测 CD4+T淋巴细胞表面 BTLA，通过FLOWJO(7.6)软件分析数据。

1.3 统计学方法 用SPSS 16.0统计软件分析，数据用均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)结合SNK-q检验或t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘模型建模鉴定

2.1.1 一般情况 正常组小鼠活动正常，无频繁挠皮肤四肢现象，呼吸平稳;哮喘小鼠雾化吸入OVA后呼吸急促、躁动不安，大小便失禁，雾化后期小鼠活动减少;地塞米松组小鼠呼吸频率增加，挠皮肤及四肢可见，但症状较哮喘组少。

2.1.2 血清IL-4和IFN-γ检测 血清IL-4在哮喘组最高，对照组最低，地塞米松治疗组介于两者之间;血清IFN-γ在对照组最高，哮喘组最低，地塞米松治疗组介于两者之间，见表1。

表1 Elisa检测血清中IL-4和IFN-γ浓度变化 (pg/ml)

2.1.3 肺组织病理学检查 经卵蛋白致敏后，急性哮喘小鼠模型肉眼可见肺部体积增大，镜下支气管周围可见EOS浸润，部分肺泡间隔融合成肺气肿，肺间质可见嗜酸性粒细胞浸润，上皮下可见杯状细胞增生;对照组未见明显异常(图1，HE×200)。糖皮质激素组仍可见炎症细胞浸润，较哮喘组嗜酸细胞减少，但比对照组明显。

图1 肺组织病理学检查 a:对照组;b:哮喘组;c:地塞米松组

2.2 BTLA在急性哮喘模型CD4+T淋巴细胞表面表达 BTLA在急性哮喘模型组CD4+T淋巴细胞表面表达较空白对照组明显增高，差异有统计学意义(t=9.299，P ＜ 0.01)，见图2。

2.3 地塞米松上调BTLA在CD4+T淋巴细胞表面表达 地塞米松治疗组急性哮喘模型CD4+T淋巴细胞表面BTLA表达上调(哮喘组VS对照组，地塞米松组VS对照组，P＜0.01;哮喘组VS地塞米松组，P＜0.05)，见图3。BTLA在非CD4+T淋巴细胞表面地塞米松治疗组与哮喘组差异无统计学意义(P ＞0.05)，见图4。

图2 BTLA在哮喘模型CD4+T淋巴细胞表面表达 a:对照组;b:哮喘组

图3 BLTA在CD4+T淋巴细胞表面表达

图4 BLTA在非CD4+T淋巴细胞表面表达

3 讨论

支气管哮喘以气道大量炎症细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等)浸润以及细胞组分参与，t同时伴气道高反应性和可逆性气道阻塞的慢性气道炎症。哮喘发病时喘息气急、胸闷或咳嗽为临床症状［1］。其病因和发病机制复杂，涉及遗传基因、免疫应答以及环境等因素，虽然近几年从基因到分子水平有大量研究，但哮喘机制仍未完全阐明。当机体接触过敏原，刺激并激活T细胞，使T细胞分化增值。目前T细胞分化时Th0细胞极化偏向Th2为目前较为明确的哮喘发病机制之一。T细胞表面受体可调控T细胞活化增殖，与Th1/Th2比例失调有一定相关关系。T细胞活化时第二信号(共刺激受体)可协助第一信号促发下游信号，调控T细胞活化［4］。CTLA-4和PD-1作为经典负向共刺激受体参与负调控免疫应答，CTLA-4Ig可有效抑制过敏所致气道炎症［11］。近期研究发现 BTLA/HVEM通路同样可调控T细胞免疫应答，抑制T细胞增殖［12］，BTLA基因敲除促使T细胞增殖及活化增加［13，14］。BTLA可抑制T细胞活化或促使细胞凋亡，降低机体的免疫应答反应，地塞米松促使CD4+T淋巴细胞表面BTLA表达上调，加强负性共刺激受体对T细胞免疫应答的负调控，降低免疫反应。

BTLA败血症小鼠炎症细胞活化增多［15］，BTLA缺陷导致过敏小鼠致气道炎症高峰推迟及持续时间延长［9］。PD-1小鼠抗炎症因子及其前体均受抑制［16］，影响范围较广;而BTLA仅影响IL-10释放来调节免疫应答［15］，BTLA较PD-1能够更为精准控制炎症发展。本实验发现哮喘模型中活化CD4+T淋巴细胞BTLA表达增高，提示BTLA可抑制气道炎症并缩短气道炎症作用时间，防止炎症反应过强而导致的周边组织形成病理性损伤。

糖皮质激素的抗炎作用可有效控制哮喘发作，抑制哮喘发病中活化炎症相关基因表达从而发挥抗炎作用，是目前治疗哮喘一线用药。那么地塞米松是否能通过BTLA的表达参与气道炎症反应的调控呢?本实验中急性哮喘模型给予地塞米松，CD4+T淋巴细胞BTLA表达进一步上调，同时HE观察可见气道炎症细胞浸润改善。地塞米松可促使活化CD4+T淋巴细胞表面BTLA上调，从而增强其对气道炎症的抑制作用，可能是地塞米松在哮喘急性发作期迅速起效的作用机制之一。

本研究结果显示，急性哮喘模型CD4+T淋巴细胞BTLA明显升高，CD4+T淋巴细胞表面BTLA表达与哮喘发病有一定相关性。地塞米松可促进CD4+T淋巴细胞BTLA表达，通过BTLA抑制气道炎症的发生发展。地塞米松BTLA表达的上调作用为哮喘研究及治疗提供新的研究方向。

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