白藜芦醇对哮喘小鼠气道炎症干预作用的研究

滕 鸿，刘跃建，胡 敏

(1.四川省医学科学院.四川省人民医院呼吸科，四川 成都 610072;2四川大学华西第二医院公共实验室，四川 成都 610041)

支气管哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞和气管平滑肌细胞参与的慢性气道炎症;部分哮喘患者即使采用正规的糖皮质激素和支气管舒张剂治疗，仍反应不佳，最终影响疾病转归。因此，有必要探索新型药物，作为哮喘治疗有益的补充。白藜芦醇(Resveratrol，3，4'，5 三羟基二苯乙烯)是一种在植物受到病原进攻和环境恶化时产生的植物抗毒素，在中药虎杖中含量丰富［1］，具有抗炎、抗氧化、抗癌、镇咳、平喘、调节血脂等重要作用。2012年5月建立小鼠慢性哮喘模型，研究口服白藜芦醇能否抑制哮喘气道炎症，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 哮喘小鼠模型的建立 雌性SPF级BALB/c小鼠18只，8～10周龄，分为白藜芦醇组、阳性对照组、阴性对照组各6只。白藜芦醇组、阳性对照组在第0、14天腹腔注射卵清蛋白(OVA)20μg(Sigma，溶于2.25 mg/100μl氢氧化铝)。致敏结束后用1%OVA雾化。每周2次共5周。阴性对照组第0、14天腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)，生理盐水雾化。白藜芦醇组用白藜芦醇灌胃(白藜芦醇50mg/kg，用去离子水、花生油、羧甲基纤维素钠、吐温80配置成乳剂)，致敏结束后隔日1次。阴性及阳性对照组用溶剂灌胃。

1.2 标本的制备与检测 ①支气管肺泡灌洗液和血清分析:末次OVA雾化12小时后，眶后静脉采血，分离血清，–70℃冻存。用 ELISA试剂盒(Jingmei Biotec)检测血清IL-4，IFN-γ和IgE含量。右肺用0.2 ml生理盐水灌洗三次收集灌洗液，离心，瑞氏染色，计数嗜酸性粒细胞。②组织学和免疫组化分析:末次OVA雾化12小时后将小鼠断颈处死，切片(5μm)分别用苏木素/伊红(H.E.)和阿尔新蓝/过碘酸希夫(AB/PAS)染色，PAS阳性细胞呈粉色，AB/PAS阳性细胞呈紫色。显微镜下计算AB/PAS阳性细胞占支气管总上皮细胞的比例。ABC法(Vector)免疫组化染色，切片经多克隆抗体(MMP-9、NF-кB)孵育，阴性对照用 PBS代替一抗。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用F检验及q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对哮喘小鼠气道慢性炎症抑制作用 如表1所示，与阳性对照组比较，白藜芦醇组灌胃后嗜酸性细胞明显减少，肺部H.E切片的组织学分析结果与支气管肺泡灌洗液的结果一致;阳性对照组的炎性细胞浸润明显增加。在OVA雾化时，白藜芦醇组咳嗽、喘息和烦躁表现弱于阳性对照组。

表1 三组支气管肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞和嗜酸性粒细胞计数(个/0.1ml)

2.2 白藜芦醇对IgE和Th1/Th2细胞因子的影响白藜芦组及阴性对照组与阳性对照组比较，IgE、IL-4水平降低(P＜0.05)。IFN-γ的水平的变化情况与此刚好相反，阳性对照组降低，经白藜芦醇灌胃后有所回升(P＜0.05)，见表2。

表2 血清 IgE、IL-4、IFN-γ 定量

2.3 白藜芦醇抑制杯状细胞的分泌 阳性组能观察到较多的粉色和紫色细胞，显示黏液分泌旺盛，AB/PAS阳性细胞比例分别为阴性对照组(3±2)%、阳性对照组(44±10)%、白藜芦醇组(12±5)%(P＜0.05)。白藜芦醇组粉色和紫色的信号强度更接近于正常小鼠的水平(图1)。

图1 粘多糖染色(×200)a:阴性对照组;b:阳性对照组;c:白藜芦醇组

2.4 白藜芦醇对 MMP-9和 NF-кB的影响 用ImageProPlus分析系统测定5个高倍视野阳性细胞面积及累积光密度IOD值，分别为阴性对照组2294±835、阳性对照组 4155±1750、白藜芦醇组 3210±1146。和阳性组小鼠比较，白藜芦醇组小鼠支气管上皮细胞的MMP-9和NF-кB的表达量有明显下降(P ＜0.05)(图2、图3)。

图2 肺组织MMP-9染色(×200) 图3 肺组织NFkB染色(×200)a:阴性对照组;b:阳性对照组;c:白藜芦醇组

3 讨论

白藜芦醇能抑制花生四烯酸的代谢产物HHT、TXB2的形成。对于肥大细胞的炎症介质释放过程，白藜芦醇有非特异性的抑制作用。在体外实验中，被IgE刺激后的肥大细胞所分泌的组胺、白三烯、前列腺素D2和TNF都被白藜芦醇明显地抑制［2］，因此白藜芦醇具有抗炎、抗过敏作用。白藜芦醇能提高一氧化氮合酶(iNOS)活性进而导致一氧化氮(NO)含量增加。抑制细胞外钙的内流和细胞内钙的释放［3］。本文在小鼠的支气管哮喘模型中，从行为学、病理学、血清学、细胞学等角度对白藜芦醇潜在的治疗效果加以评价。

实验发现通过口服白藜芦醇(50mg/kg)能在一定程度上抑制小鼠的哮喘症状如呼吸急促、咳嗽、烦躁;嗜酸性粒细胞的计数有明显降低。白藜芦醇组小鼠的支气管平滑肌厚度变薄、炎性细胞浸润减少;支气管壁杯状细胞分泌的粘多糖也有明显减少。此外，哮喘相关的抗体(IgE)和细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平都有相应的变化，这些变化提示Th1和Th2细胞系之间的平衡在向不利于哮喘的方向发展。MMP-9在病理情况下如急慢性哮喘、慢性阻塞性肺病中表达量明显增加［4］，而NF-кB能调节涉及哮喘病理生理的多种细胞因子、趋化因子、细胞黏附分子的分泌;已有文献报道通过选择性地抑制气道上皮NF-кB的功能可减少OVA致敏的哮喘小鼠的粘液分泌［5］。免疫组化分析显示哮喘相关蛋白比如MMP-9和NF-кB的表达量有所下降，提示白藜芦醇能通过这些蛋白影响哮喘的病理生理过程。

富含白藜芦醇的中药虎杖在镇咳平喘方面一直有较为广泛的应用。作为一种与Th1/Th2细胞因子失衡、气道高反应相关的急慢性气道炎症疾病，白藜芦醇的多种生物学活性都能够使之受益。本课题利用小鼠模型证明了白藜芦醇在哮喘治疗方面有一定的应用前景。

［1］修清玉，唐昊.哮喘药物治疗进展［J］.实用医院临床杂志，2009，5(4):95-97

［2］Seon-Young H.Inhibitory effects of dietary resveratrol on anaphylactic reaction and IgE-mediated allergic response in basophilic mast cells［J］.FASEB J，2010，24:723.

［3］Ekshyya N.Resveratrol inhibits rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation via estrogen receptor dependentnitric oxide production［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2007，50(1):83-93.

［4］Araujo BB.Extracellularmatrix components and regulators in the airway smooth muscle in asthmaEur［J］.Respir J，2008，32:61-69.

［5］Rico-Rosillo G.The involvement of NF-кB Transcription factor in asthma［J］.Rev Alerg Mex，2011，58(2):107-111.