内源性粒细胞集落刺激因子对非小细胞肺癌化疗后白细胞的影响

屈晶晶，胡成平，顾其华

(中南大学湘雅医院呼吸内科，湖南 长沙 410008)

原发性支气管肺癌(简称肺癌)为起源于支气管黏膜上皮及腺体的恶性肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一［1］。晚期不可手术的非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者数量巨大，既往姑息性治疗效果差，长期生存率低，化疗为主的综合治疗是重要的治疗手段。在化疗过程中，足量或者长期使用化疗药物可以直接损伤骨髓微环境或髓系祖细胞而引起白细胞的下降［2］。有报道证实肿瘤细胞能分泌生长因子如粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)。G-CSF 是粒系造血促进白细胞生成的核心因子。最新的研究数据表明在第一个化疗周期结束后白细胞下降占48%，而在第一个化疗周期前接受重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)治疗的患者其白细胞的下降率减少了60%［3］。为何有52%的患者在第一个化疗周期后白细胞并无明显的下降，基于此，本研究主要通过对NSCLC患者化疗前后G-CSF及白细胞表达水平进行测定，探讨内源性G-CSF表达水平与化疗后白细胞的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集中南大学湘雅医院2012年4～11月住院的NSCLC患者94例，平均年龄20～74岁，年龄54.7岁。94例患者中接受化疗71例(试验组)，23例(对照组)因为经济原因拒绝化疗或者有手术指征行手术治疗者。94例患者G-CSF的表达水平、性别、临床分期、病理类型见表1。

1.2 方法 两组经知情同意后第一次抽取外周静脉血，取清晨空腹静脉血5 ml，静置20 min，以3000 r/min离心15 min，吸取血清分装于离心管内，分别编号、注明患者姓名及采血日期，保存于-20℃冰箱内，待测。避免反复冻溶。试验组化疗第6天后再次采集患者外周静脉血，对照组第二次采血的时间与其同步，检测化疗后白细胞计数及G-CSF水平。观察化疗前后患者外周血细胞计数和G-CSF水平变化。实验所需要的仪器:G-CSF酶联免疫分析试剂盒，标准规格酶标仪，高速离心机，电热恒温培养箱，洗板机。

表1 94例患者血清G-CSF浓度与临床资料

1.3 统计学方法 使用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。G-CSF值用均数±标准差表示，化疗前后白细胞计数及不同分组间的G-CSF的比较采用方差分析的方法进行多样本的检验，对化疗后白细胞计数以及内源性G-CSF的表达水平、化疗前后白细胞的比值以及G-CSF的比值进行相关性分析。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 化疗前后外周血白细胞的变化 试验组71例患者化疗前的白细胞计数为(8.9±1.2)×109/L，化疗后白细胞计数为(4.1±3.6)×109/L，化疗后白细胞计数明显低于化疗前，差异有统计学意义(t=6.89，P＜0.05)。对照组23例患者第一次采血白细胞计数为(7.6±2.5)×109/L，第二次采血白细胞计数为(6.4±1.1)×109/L，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 化疗前后G-CSF的变化 试验组71例患者化疗前G-CSF值为(0.162±0.017)ng/ml，化疗后为(0.147±0.023)ng/ml。化疗前后差异有统计学意义(t=9.58，P ＜ 0.05)。

2.3 外周血白细胞数变化与患者基础G-CSF值按照化疗后白细胞绝对值分组，对化疗后白细胞的水平分为3组，化疗后白细胞下降组(白细胞计数＜4×109/L)、白细胞正常组(白细胞计数4×109/L～10.0×109/L)、白细胞升高组(白细胞计数＞10.0×109/L)，对照组为未做化疗的患者。各组的C-CSF浓度见表2及图1。

表2 不同分组的G-CSF浓度 (ng/ml)

图1 不同组间的内源性G-CSF浓度

2.4 白细胞下降组化疗前后血清G-CSF值变化白细胞下降组30例患者化疗前血清G-CSF值为(0.089±0.049)ng/ml，化疗后为(0.034±0.027)ng/ml，化疗前后差异有统计学意义(t=3.74，P＜0.05)。

2.5 相关性分析 对71例接受化疗的患者化疗后白细胞计数与内源性G-CSF进行相关性分析，其相关系数r=0.265，P=0.000，差异有统计学意义，见图2。

图2 71例患者化疗后白细胞计数与内源性G-CSF关系的散点图

3 讨论

3.1 化疗对白细胞的影响 含铂药物的二联化疗方案仍是目前治疗晚期NSCLC的主要手段［4］。化疗药物可以引起骨髓抑制，破坏了骨髓内细胞增殖成熟与外周血液中白细胞衰老之间的平衡，导致外周血白细胞不同程度的降低。同时化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时也作用于正常细胞，特别是白细胞。本组实验数据显示:化疗后白细胞计数［(4.1±3.6)×109/L］明显低于化疗前［8.9±1.2×109/L］，差异有统计学意义(P＜0.05)，与文献报道一致。

3.2 NSCLC患者基础G-CSF水平与化疗后白细胞值的关系 在中性粒细胞的的生成过程中，GCSF起到至关重要的作用［5］:①皮下注射可以定向刺激造血干细胞包括原幼粒细胞、前髓细胞、中幼粒细胞的分化;②G-CSF可促进粒细胞集落的形成，缩短造血干细胞的休止期，促使粒细胞分化、增殖、成熟的所有过程。临床上用于化疗及骨髓移植后加速血相中性粒细胞的恢复，防止感染;③促进晚期粒系祖细胞增殖、分化、加快粒系前体细胞成熟、释放到外周血中，迅速增加外周血中的中性粒细胞计数;④G-CSF可延长成熟中性粒细胞的寿命，促进其活性酶的产生能力、细胞游走能力、吞噬和杀菌能力;⑤G-CSF动员中性粒细胞从边缘池进入血循环池的能力较强。

本研究结果显示化疗后白细胞下降组的G-CSF表达水平［(0.098±0.045)ng/m l］，明显低于白细胞正常组、白细胞升高组、对照组的 G-CSF水平［(0.150 ± 0.052)ng/ml、(0.374 ± 0.079)ng/ml、(0.111±0.045)ng/ml］，差异有统计学意义(P ＜0.05)。同时对化疗后白细胞计数与内源性的G-CSF表达水平、化疗前后白细的比值与G-CSF的比值进行了相关性分析，其相关系数分别为0.304、0.386，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示NSCLC患者化疗所致的外周血白细胞下降与患者内源性G-CSF的基础水平有关，而且呈正相关。

3.3 白细胞的变化与G-CSF变化的关系 本组研究结果显示71例化疗患者化疗后G-CSF表达水平为(0.147±0.023)ng/ml，低于化疗前的(0.162±0.017)ng/ml;30例白细胞下降组化疗后的血清GCSF表达水平为(0.034±0.027)ng/ml，明显低于化疗前的(0.089±0.049)ng/ml，差异有统计学意义(P＜0.05)。化疗后白细胞的下降与G-CSF表达水平的下降是一致的，那么白细胞的下降除了与内源性的G-CSF表达水平相关以外，是否因为化疗药物干扰了G-CSF的调控机制，从而影响了白细胞的生成?独立生长因子(Gfi1)基因定位于人染色体1p22［6］，Gfi1 可以促进 RasGRP1(Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白1)的表达，对G-CSF的调控有增强的作用［7］。有文献报道Gfi1突变可以抑制RasGRP1从而减少G-CSF的生成，引起中性粒细胞减少症，因此Gfi1在髓系细胞的发生中发挥重要作用，是调控内源性粒细胞集落刺激因子的主要转录因子［8］。G-CSF与其受体G-CSFR结合后可以激活JAKSTAT信号转导通路。G-CSF诱导酪氨酸磷酸化激活JAK，进而诱导受体酪氨酸磷酸化，诱导STAT家族激活，促进中性粒细胞的生成［9～12］。Ras-MAPK也是造血细胞膜GCSFR后的一个重要信号传导通路。现在的研究认为G-CSF与G-CSFR结合后可以通过Ras-MEK/Erk信号通路，促进中性粒细胞生成以及骨髓前体细胞向粒细胞分化［13］。而cxc家族趋化因子受体Cxcr2、基质细胞源性因子Cxcl5可以抑制G-CSF轴从而调控中性粒细胞的动态平衡，对G-CSF的调控起到负反馈的作用［14］。患者化疗的过程中，是否因为化疗药物因为抑制了Gfi1生长因子，或者激活了Cxcr2、Cxcl5影响了G-CSF的调节通路，干扰JAK-STAT、Ras-MEK/Erk的信号通路从而抑制了髓系细胞分化和中性粒细胞的生成，这有待于进一步的研究。

我们前期的研究表明化疗后中性粒细胞数量降低者，生存时间反而长，而且无症状生存期与中性粒细胞未降低者相比无明显差异，说明中性粒细胞数量增加在一定程度上影响了肿瘤的进展［15］。Bellocq等［16］研究认为肿瘤组织中浸润的中性粒细胞越多，患者的预后越差。综上所述，非小细胞肺癌患者化疗所致的外周血白细胞变化与非小细胞肺癌患者的G-CSF呈正相关，预防性的使用G-CSF可以降低化疗后白细胞下降这一不良反应，同时也应该掌握好rhG-CSF的使用剂量，因为有文献也有报道过高G-CSF可能会降低化疗的疗效，我们前期的研究工作显示化疗后白细胞降低者，其生存时间反而长。

［1］Detterbeck FC，Boffa DJ，Tanoue LT.The New Lung Cancer Stagy System.Chest，2009，136(1):260-271.

［2］Kasuga I，Makino S，Kiyokawa H，et al.Tumor-related leukocytosis is linked-with-poor-prognosis-in-patients-with-lung-carcinoma［J］.Cancer，2001，92(9):2399-2405.

［3］Inoue M，Minami M，Fujii Y，et al.Granulo cytecolony-stimulating factor and interleukin-6-producing-lung-cancer-cell-line，LCAM［J］.JSurg Oncol，1997，64(4):347-350.

［4］Kosmidis P.Chemotherapy in NSCLC:historical review［J］.Lung Cance，2002，38(Suppl3):S19-22.

［5］Price TH，Chatta GS，Dale DC，et al.The effect of recombinantgranulocyte colony-stimulating factor on neutrophil kinetics in normal young and elderly humans［J］.Blood，1996，88:335-340.

［6］Robert T，Cowell JK.Cloning of the human Gfi-1 gene and itsmapping to chromosome regine［J］.Oncogene，1997，14(8):1003-1005.

［7］Huang M，Hu Z，Chang W，et al.The growth factor independence-1(gfi1)is overexpressed in chronic myelogenous leukemia［J］.Acta Haematol，2010，123(1):1-5.

［8］Stone JC.Regulation and Function of the RasGRP Family of Ras Activators in Blood Cells［J］.Genes Cance，2011，2(3):320-334.

［9］Kamezaki K，Shimuda K，Numata A，et al.Rules of stat3 and Erk in G-CSF signaling［J］.Stem Cells，2005，23:252-263.

［10］Sloand EM，Yong AS，Ramkission S，et al.Granulocyte colony-stimulating factor preferentially stimulates proliferation of monosorny T cells bearing the isoform Ⅳreceptor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:14483-14488.

［11］Jiang K，Hein N，Eckert K，et al.Regulation of the MADI promoter by G-CSF［J］.Nucleic Acids Res，2008，36:1517-1531.

［12］Jack GD，Zhang L，Friedman AD.M-CSF elevates c-fos and phosphor-c/EBPalpha(s21)via ERK whereas G-CSF stimulates SHP2［J］.Blood，2009，114:2172-2180.

［13］Dela M，Sakakibara S，Gasperini P，et al.The transcription factor gfi1 regulates G-CSF signaling and neutrophil development through the Ras GRP1［J］.Blood，2010，115:3970-3979.

［14］Junjie M，Yuhong L，Ning D，et al.Cxcr2 and Cxcl5 regulated the IL-7/G-CSF axis and neutrophil homeostasis in mice［J］.JClin Invest，2012，122(3):974-986.

［15］李娜，顾其华，胡成平.白细胞数量稳定性与晚期非小细胞肺癌患者化疗预后的相关性研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2012，19:63-67.

［16］Bellocq A，Antoine M，Flahault A，et al.Neutrophil alveolitis in bronchioloveolar carcinomo:induction by tumor-derived interleukin-8 and ralation clinical outcome［J］.Am JPathol，1998，15(2):83-92.