辣椒碱促进结肠癌转移的实验研究

朱剑梅，金 科

(四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区，四川 成都 610101)

结肠癌是目前我国最常见的癌症之一，癌症转移是结肠癌治疗中一个难点。间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)是恶性肿瘤的一个非常重要的起始事件。研究报道炎症因子与癌症转移密切相关［1］。辣椒碱是辣椒中的主要活性成分。近年的研究表明，一定浓度的辣椒碱能引起一系列炎症因子的高表达，具有抗凋亡和促进血管生成的作用［2］。因此，研究辣椒碱与结肠癌转移的相关机制，具有较高的学术研究和实际应用价值。研究时间:2012年1～10月。研究地点:四川大学生物治疗国家重点实验室。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人结肠癌细胞系SW 480购买于美国标准生物品收藏中心(ATCC)，辣椒碱(纯度大于95%)购买于四川金辉公司，癌症转移的maker蛋白抗体购买于北京中杉金桥，Transwell小室和基质胶购买于美国Sigma公司。

1.2 方法 ①用MTT法检测辣椒碱对sw480细胞增殖的影响:将生长良好的SW480细胞以2×103个/孔接种于96孔板中培养24 h，将不同浓度辣椒碱(640、320、160、80、40、20 和 10 μM)加入 96 孔板中培养48 h，加入20μl噻唑蓝(MTT)(5mg/ml)继续培养4 h，去培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min，在490 nm波长酶标仪检测OD值。②细胞划痕实验检测细胞迁移［3］:将生长良好的SW480细胞以6×104个/孔接种于六孔板中培养24 h，待密度达到90%时，用200μl的枪头轻轻在六孔板中划过，用1 m l双无培养基清洗三次，加入辣椒碱和DMSO分别处理48 h。放入孵箱培养48 h。48 h后倒置显微镜观察并照相。③Transwell、基质胶实验检测辣椒碱对细胞转移的影响:细胞侵袭和浸润实验在Transwell小室中进行［4］。于10倍显微镜下观察并照相，将膜上下左右5个视野计算穿过的细胞数，求其平均值。④WB检测相关蛋白表达:将经过辣椒碱处理的SW480细胞裂解液用SDS-PAGE分离，根据蛋白质免疫印记(Western blotting，WB)方法［5］将蛋白质转移到 PVDF 膜上，然后用 25 m l TBST(Tris，2.422 g;Nacl，8.775 g;Tween20，1 ml，蒸馏水至 1000 ml;pH 7.4)洗膜 5 min。置膜于25 ml封闭缓冲液(含0.1%TweenTBST溶液配制的5%脱脂牛奶中1 h，室温，摇动。15 ml TBST洗3次(5 min每次)。加入1︰200稀释的相应的一抗，37℃ 孵育2 h，缓慢摇动。15 ml TBS/T洗3次(5 min每次)。加入相应的二抗室温孵育1 h，摇动。然后用15 ml TBS/T洗3次(5 min每次)。15 mL TBS洗1次。加入WB显影液，放于化学发光仪的暗室中曝光，照相并数据分析。

2 结果

2.1 辣椒碱对结肠癌细胞和浸润能力的影响MTT法检测结果显示SW 480细胞在40～80μM浓度的辣椒碱作用下出现增殖现象(图1)。划痕实验结果显示细胞向划痕处生长并靠拢(图2)，Transwell、基质胶实验结果显示辣椒碱处理的SW 480比未经药物处理明显增多(图3、图4)。

图1 不同浓度的辣椒碱作用于SW 480细胞48 h的抑制率

图2 划痕实验检测80μM的辣椒碱促进SW480转移

图3 Transwell检测辣椒碱对SW480迁移的影响

2.2 辣椒碱对结肠癌细胞转移基因表达的影响80μM辣椒碱处理48 h后，SW480细胞中的E-cadherin明显减少，并增强了N-cadherin和Vimentin的表达，也增强了信号分子β-catenin的表达，MMP-9、MMP-2及VEGF的表达也明显增强(图5)。

图4 基质胶检测辣椒对SW480浸润的影响

图5 癌症转移过程标志蛋白的免疫印记，辣椒碱促进恶性基因表达

3 讨论

肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一。近年来的研究表明，EMT是癌症转移过程中最重要的启示事件。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得侵袭能力及发生远处转移的重要生物学过程，是肿瘤细胞转移启动中最重要的机制。它表示表皮细胞向间质细胞转变的过程。这个过程的改变加强了细胞的迁移和侵袭能力。N-cadherin、E-cadherin、β-catenin是EMT发生的重要标志。本研究发现辣椒碱能促进肿瘤细胞迁移和侵袭能力，主要是通过增强细胞EMT产生的，但具体机制还需要进一步研究。

上皮癌细胞中，迁移和浸润能力增强往往伴随着形态的改变［6］，如上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。在癌症转移过程中恶性基因MMP-9和MMP-2的表达有助于细胞间基质的降解［7］。同时VEGF基因与结肠癌肿瘤血管生成、转移和肿瘤生长密切相关［8］。已有报道称辣椒碱抑制VEGF所介导的血管生成［9］。Kalluri等报道称辣椒碱激活一系列恶性基因(如MMP-2)的表达而提高细胞的转移能力［10］，如乳腺癌;Sara等研究报道称辣椒碱能够促进乳腺癌细胞向肺和心脏转移［11］。以上这些研究表明辣椒碱的生理功能是受到很多因素的影响，包括浓度、组份、细胞类型等。本研究发现低浓度辣椒碱促进SW480的转移，证明辣椒碱具有多种生物功能，这与辣椒碱的浓度可能存在相关性。

本研究结果表明辣椒碱促进了结肠癌的转移，调节EMT途径中关键蛋白的表达。但需要进步研究辣椒碱对不同细胞系的影响和机制，探索辣椒碱的生物学功能。

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