丝氨酸蛋白酶抑制剂在卵巢癌发展和血管生成中的作用机制研究

马 瑛，彭芝兰，陈 欣

(1.四川大学华西第二医院妇产科，四川 成都 610041;2.四川省绵阳市中心医院妇产科，四川 绵阳 621000;3.成都地奥集团筛选中心，四川 成都 610041)

卵巢癌恶性程度高、缺乏早期诊断手段，虽对化疗比较敏感，但化疗药物的毒副反应及长期治疗易产生耐药等因素，都导致卵巢癌的临床治疗有一定困难。肿瘤的生长和转移是血管依赖性的，卵巢癌组织有血管丰富、生长迅速的特点，抗卵巢癌血管形成是一种新的治疗策略。丝氨酸蛋白酶抑制剂(mammary serpin，MASPIN)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的新成员，大量研究发现它作为肿瘤抑制基因对肿瘤的生长、侵袭、转移有明显抑制作用，近来更被证实是一种有效的血管生成抑制因子［1］。本研究通过免疫组织化学LSAB方法检测MASPIN、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)组织中的表达，分析其与卵巢癌病理类型、病理分级、手术病理分期等病理特点的关系;体外实验进一步检测卵巢癌细胞中MASPIN高表达对VEGF和表达的影响，旨在探讨MASPIN在卵巢癌的发展和血管生成中的作用，为以MASPIN为分子靶点的抗肿瘤基因治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究采用的EOC组织(35例)为2004年10月至2005年4月在四川大学华西第二医院妇科接受手术治疗患者(年龄35～68岁)的新鲜卵巢组织标本，术前未行化疗、放疗或生物治疗，术后病理诊断确诊并且患者临床病理资料完整，病理诊断均由有经验的病理专家复核。病理类型:浆液性腺癌22例，黏液性癌5例，子宫内膜样腺癌5例，透明细胞癌 3例;病理分级:高分化 3例(8.6)，中分化6例(17.1)，低分化26例(74.3);临床分期I期14例(40.0)，Ⅱ 期2例(5.7)，Ⅲ 期l1例(31.4)，IV期8例(22.9);淋巴结转移:有转移8例(22.9 9/6)，无转移27例(77.1);腹水:有腹水19例(54.3)，无腹水16例(45.7)。同期正常卵巢组织31例(子宫肌瘤21例、子宫腺肌症10例)。卵巢组织的获取均事先向患者说明，并取得同意。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗人MASPIN抗体(AbS4A)购自Calbioehem公司，鼠抗人VEGF单抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、高保真 pfu DNA聚合酶、λEcoT14 I digest购自 MBI;T4-DNA连接酶购自NEB;PCR产物纯化试剂盒购自申能博彩生物科技有限公司，质粒纯化试剂盒为Omega公司产品;PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成。Trizol Reagent(Invitrogen)，TaKaRa One step PCR for RNA Kits(AMV)购自天泰生物技术有限公司。转染试剂梭华-SofastTM购自厦门太阳马生物工程有限公司;荧光素酶底物试剂购自Promega公司(CAT.NO.E1531);细胞培养材料购自成都哈里公司。Forma-80℃冰箱;BECKMAN冷冻高速离心机;eppendorf台式高速离心机;BIORAD电泳槽，电泳仪;恒温水浴箱，恒温空气摇床，恒温空气培养箱，恒温烤箱;Hybaid PCR仪;Kodak凝胶成象系统及图象分析软件。HARRISCO2孵箱，NUAIRE超净工作台，倒置显微镜，96孔细胞培养板，Wallace Victor2多功能发光检测仪(PerkinElmer公司)，DU 640(BECKMAN COULTERTM)分光光度计;酶标仪 MICROPLATE READER(BIO-RAD公司)。BIORAD扫描仪。

1.3 质粒载体、宿主菌和细胞 pCDNA3-MASPIN、大肠杆菌JM109、人体正常前列腺组织由成都地奥集团药物筛选中心提供。SKOV3为人卵巢浆液性上皮癌细胞株，由四川大学华西第二医院实验中心妇科肿瘤实验室提供。

1.4 免疫组织化学检测MASPIN、VEGF在卵巢癌组织中的表达 将切除的新鲜标本经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度4 Fm。免疫组织化学染色步骤按试剂盒说明进行。用PBS代替一抗作为阴性对照，公司提供的阳性切片为阳性对照。MASPIN抗体(1∶400)、VEGF抗体(1∶200)稀释。MASPIN、VEGF阳性为胞浆棕色颗粒沉着，用Olympus DP70采图系统捕获图像，采用Laserpix图像分析软件进行分析，测定IOD。

1.5 MASPIN稳定表达细胞株的构建 ①SKOV3细胞培养、传代和保种:人卵巢癌细胞株SKOV3细胞培养、传代、保种参照司徒振强的《细胞培养》［2］。②细胞转染及转染克隆的筛选:用阳离子聚合物法介导DNA转移，转染后将细胞置于37℃，5%CO2孵育箱孵育。设未转染细胞作对照，用梯度浓度的G418筛选培养液进行筛选，G418的最适浓度为700 μg/ml。每3天换一次液，2周后挑取抗G418克隆扩增，分别命名为 SKOV3-MASPIN和 SKOV3-vector，并进行 RT-PCR和Western blot、ABC免疫酶染色法鉴定。③细胞总RNA的提取:用Trizol Reagent提取SKOV3细胞总RNA，样本为转染了pcDNA3-MASPIN、pcDNA3空载体质粒的SKOV3细胞和未转染的SKOV3细胞，方法参照试剂说明书进行。取少量RNA以电泳鉴定完整性，以紫外分光光度法检测浓度和纯度。调整浓度存放于-70℃备用。

1.6 半定量逆转录聚合酶链反应RT-PCR分析用于半定量RT-PCR分析的引物序列Primer Premier 5.0设计软件设计，同时设计内对照基因GAPDH引物，扩增片段大小约485 bp。RT-PCR分析采用TAKARA公司的ONE STEP RT-PCR试剂盒，依据说明进行。

1.7 ABC免疫酶染色法检测 MASPIN、VEGF、HPA蛋白的表达 SKOV3及G418筛选阳性的细胞，用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，以1×106密度将细胞分别接种于预先放置盖玻片的6孔培养板，置孵箱培养2天，取出盖玻片，浸入磷酸盐缓冲液PBS洗2次，加4%PFA(多聚甲醛)固定30分钟，用PBS洗5分钟×3次。0.3%H2O2-甲醇10秒，PBS洗5分钟×3次。0.1%triton×100室温下5分钟，PBS洗5分钟×3次。5%BSA(牛血清白蛋白)封闭，室温下10分钟，不洗，弃多余液体。染色步骤按试剂盒说明进行。每批实验中均设立阳性和阴性对照，试剂公司提供的阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。MASPIN抗体(1∶100)、VEGF抗体(1∶200)。用Olympus DP70采图系统捕获图像，每组细胞取4个视野，采用Laserpix图像分析软件进行分析，测定IOD。

1.8 统计学方法 所有计算均用SPSS 13.0软件进行，由统计学专业人员进行统计学分析。分类资料率的比较采用卡方检验，MASPIN、VEGF与临床各病理指标的比较采用两组独立样本的t检验。VEGF、MASPIN之间的相关性比较采用直线或秩相关分析。三组及以上资料的比较，首先进行方差齐性检验，方差齐者用多组计量资料的方差分析进行比较，如有意义则采用q检验两两比较。采用Kodak软件对RT-PCR条带进行光密度值分析，分别以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和肌动蛋白(β-actin)作系统内参。通过计算对目的基因的表达进行半定量。目的基因的表达指数=目的基因条带的光密度值/相应内参照条带的光密度值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MASPIN、VEGF在EOC的表达以及EOC临床病理特点

2.1.1 MASPIN、VEGF在EOC中的表达 MASPIN蛋白主要为细胞浆表达(图1)，在正常卵巢生发上皮细胞和EOC细胞的阳性表达分别为16.1%(5/31)和57.1%(20/35)，差异有统计学意义(χ2=10.07，P＜0.01)。VEGF蛋白的阳性表达定位于细胞浆，周围的血管内皮细胞也有阳性表达(图2)，其白在正常卵巢生发上皮细胞和EOC细胞的阳性表达分别为25.8%(8/31)和77.1%(27/35)，差异有统计学意义(χ2=15.39，P ＜ 0.01)。

图1 MASPIN在卵巢癌中的阳性表达(IHC)200×

图2 VEGF在卵巢癌中的阳性表达(IHC)200×

2.1.2 MASPIN、VEGF表达与EOC临床病理特点见表1。其中MASPIN蛋白在非浆液性卵巢癌中表达高于浆液性卵巢癌中的表达，MASPIN蛋白表达还随着手术－病理分期的进展而下调，在I+II期和III+IV期中IOD值差异有统计学意义(P＜0.05);在无腹水组中MASPIN蛋白表达高于有腹水组，差异有统计学意义(P＜0.05);淋巴结转移各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。在有腹水组和无腹水组IOD值分别为2.8466±1.4283和1.5526±1.3275，差异有统计学意义(P＜0.05)。在其余各组间VEGF蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 M ASPIN、V EG F表达与临床病理指标

2.1.3 MASPIN与VEGF的相关性 分析发现MASPIN与VEGF呈负相关(r=－0.738，P＜0.05)，即MASPIN的表达水平越高，VEGF的表达则相应的降低。

2.2 转染克隆的鉴定

2.2.1 AB免疫酶染色 SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN组的IOD值分别为493.5075±394.3448、415.5225 ± 144.8998、3629.547 ±1602.8288。SKOV3、SKOV3-pcDNA3 细 胞 中MASPIN表达差异无统计学意义(P＞0.05)，而转染MASPIN－cDNA的SKOV3-MASPIN细胞中MASPIN表达较转染前及空载体组差异有统计学意义(P＜0.05)，即转染 MASPIN－cDNA的 SKOV3-MASPIN中MASPIN表达增强(图3～图5)。

2.2.2 RT-PCR SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN细胞采用RT-PCR方法，用Kodak凝胶成象系统及图象分析软件存储图象并分析结果，以MASPIN与GAPDH基因扩增产物电泳带的光密度比值，反映MASPIN的表达水平(图6)。结果显示，SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN 组的光密度比值分别为 0.6720±0.0131，0.6674±0.0128，1.0560±0.0052。SKOV3-MASPIN组 MASPIN表达水平明显升高(P＜0.05)。而SKOV3、SKOV3-pcDNA3组MASPIN表达变化差异无统计学意义(P＞0.05)。

图3 SKOV3细胞中的MASPIN表达(IC)400× 图4 SKOV3-vector细胞中的MASPIN表达(IC)400× 图5 SKOV3-MASPIN细胞中的MASPIN表达(IC)400× 图6 筛选克隆的PCR扩增鉴定

2.2.3 Western Blot SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN细胞采用 Western Blotting方法，用BIORAD扫描仪捕获图像，Kodak图象分析软件分析结果，以MASPIN与β-actin带的光密度比值，反映MASPIN的表达水平(图7)。结果显示，SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN组的光密度比值分别为 0.7823±0.0108，0.7653±0.0186，1.6549±0.1074。SKOV3-MASPIN组MASPIN表达水平明显升高 (P ＜0.05)。SKOV3、SKOV3-pcDNA3组MASPIN表达差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 MASPIN过表达对VEGF表达的影响

2.3.1 MASPIN过表达对VEGF的mRNA表达的影响 SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN 细胞采用RT-PCR方法，用Kodak凝胶成象系统及图象分析软件存储图象并分析结果，以VEGF与GAPDH基因扩增产物电泳带的光密度比值，反映MASPIN的表达水平(图8)。结果显示，SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN组的光密度比值分别为 1.015±0.018、0.991±0.010和 0.901±0.010。SKOV3-MASPIN组VEGF表达水平明显降低(P＜0.05)。SKOV3、SKOV3-pcDNA3组 VEGF表达差异无统计学意义(P＞0.05)。

图7 pcDNA3-MASPIN在SKOV3细胞中稳定转染的Western Blot结果 1.SKOV3总蛋白;2.SKOV3/pcDNA3总蛋白;3.SKOV3/pcDNA3-MASPIN总蛋白 图8 PCR结果 1:SKOV3;2:SKOV3/pcDNA3;3:SKOV3/pcDNA3-MASPIN

2.3.2 MASPIN过表达对VEGF蛋白表达的影响采用ABC免疫酶染色法检测转染MASPIN前后VEGF蛋白表达的变化。SKOV3、SKOV3-pcDNA3和SKOV3-MASPIN组的IOD值分别2350.257±1386.7257、2440.083±1006.6204 和 331.0025±212.0308。SKOV3、SKOV3-pcDNA3细胞中 VEGF表达差异无统计学意义(P＞0.05)，而转染MASPIN－cDNA的SKOV3-MASPIN细胞中VEGF表达较转染前及空载体组差异有统计学意义(P＜0.05)，转染 MASPIN－cDNA的 SKOV3-MASPIN细胞中VEGF表达下降(图9～11)。

图9 SKOV3细胞中的VEGF表达(IC)400×

图1 0 SKOV3－vector细胞中的VEGF表达(IC)400×

图1 1 SKOV3－MASPIN细胞中的VEGF表达(IC)400×

3 讨论

MASPIN是一种新的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，MASPIN的表达随着肿瘤的发展而逐渐消失，恢复肿瘤细胞中MASPIN的表达，能够抑制肿瘤细胞的生长、运动、转移能力，因此将其定位为肿瘤抑制基因［3］。随着对MASPIN内在分子机制的深入研究发现在不同类型的细胞中，MASPIN表达形式不同，发挥的作用也不相同，MASPIN的表达与功能也尚无定论。Boltze等［4］对结肠癌的研究发现，MASPIN在88%～100%的腺瘤和正常组织以及69%的肿瘤中表达阳性，且MASPIN的弱表达或阴性表达与肿瘤复发呈正比。与之相反，Song等［5］研究发现Maspin在由正常胃组织向胃癌的进展中表达水平逐渐升高，且与肿瘤分期、淋巴结转移相关，认为Maspin在胃癌进展、脉管形成及转移中扮演着重要角色。

为探讨MASPIN在卵巢癌发展中的作用，本研究采用LSAB法检测了MASPIN蛋白在31例正常卵巢组织和35例卵巢癌组织中的表达，发现MASPIN蛋白主要定位于细胞浆，在正常卵巢组织中为阴性或弱阳性表达，阳性率为16.1%(5/31)，与卵巢癌组织中的57.1%(20/35)相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。手术病理分期是对卵巢癌治疗和预后影响最大的指标［6］，本研究结果显示，MASPIN蛋白表达在早期EOC(I、II)高于晚期(III、IV)，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明MASPIN的表达随着卵巢肿瘤的进展而下调。从病理类型分析，MASPIN蛋白在非浆液性卵巢癌中表达高于在浆液性卵巢癌中表达，即MASPIN主要在非浆液性癌中表达，而浆液性癌的5年存活率低于黏液性和子宫内膜样癌［7］。据报道有腹水与无腹水组患者相比，前者的 5年生存率仅为 5%，而后者达45%［8］。这也说明MASPIN能在一定程度上抑制卵巢癌的转移。

本研究结果显示，MASPIN在卵巢癌中表达上调，但其与低手术-病理分期、非浆液性肿瘤、无腹水形成的相关性是与它的肿瘤抑制基因特性相符合的。

对于MASPIN在不同类型细胞中的表达水平不同、发挥作用不相同的这些矛盾结果可能有以下几种解释:①与maspin蛋白发生相互作用的相关蛋白在不同类型细胞中有特定的表达，因而maspin蛋白在不同类型细胞中的功能不同［9］;②maspin在不同细胞中的亚定位也对其功能起着关键的影响［10］;③maspin在肿瘤细胞中复杂的后生性改变，如maspin在不同细胞类型中特异表达，受到其启动子区域甲基化的控制［11］。

Zhang等［1］在对乳腺癌、前列腺癌的研究中，通过体内体外实验发现MASPIN的肿瘤抑制活性可能主要依赖其对新生血管生成的抑制能力。因此MASPIN被看作一种新的肿瘤血管抑制因子。卵巢癌是一种实体肿瘤，在肿瘤间质中存在着高密度的微血管，卵巢癌的生长转移与微血管的形成密切相关。抗血管生成基因治疗在卵巢肿瘤的动物实验中已取得了显著疗效，在卵巢癌的治疗中具有很大潜力［12］。

已有的研究结果已证实VEGF与卵巢恶性肿瘤的增殖、浸润和转移密切相关［13］。本研究中VEGF在卵巢癌细胞中的表达(77.1%)与正常卵巢组织细胞(25.8%)相比增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，还发现VEGF与腹水形成有一定相关性，进一步分析MASPIN与VEGF之间的相关性，结果显示MASPIN表达与VEGF有显著负相关性(P＜0.05)，因此推测在卵巢癌中，MASPIN具有抑制血管生成作用，并且可能与VEGF相关。

为进一步探讨MASPIN抑制卵巢癌血管生成的可能分子机制，本研究将真核表达质粒pcDNA3-MASPIN-cDNA转染卵巢癌细胞SKOV3，应用RTPCR和免疫细胞化学方法分别从基因转录和蛋白表达水平来了解过表达MASPIN对VEGF的影响，结果发现无论是基因转录还是蛋白表达水平，MASPIN对VEGF表达都有明显抑制作用(P＜0.05)，进一步说明MASPIN对肿瘤血管的抑制作用可能与VEGF有关。但MASPIN调节VEGF的内在机制目前尚无研究。有报道指出，Bcl-2基因可能对 VEGF 的表达有一定调控作用［14，15］而 MASPIN可以通过包括线粒体和Bcl-2蛋白家族在内的信号转导途径增强内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡［16～18］。因此推测MASPIN对VEGF的调节可能是通过抑制Bcl-2基因的表达、增强内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡的途径来发挥作用的。

综上所述，与正常卵巢组织相比，MASPIN基因在卵巢癌中表达上调，但MASPIN在卵巢癌的发展过程中可能仍发挥着肿瘤抑制基因的作用。MASPIN能从蛋白质和mRNA水平下调卵巢癌中VEGF的表达，并可能通过这一机制抑制卵巢癌血管生成。MASPIN表达对卵巢肿瘤进展和血管生成的抑制作用，为以MASPIN为基础的抗肿瘤血管生成基因治疗提供了有利的理论依据。

［1］Zhang M，Volpert O，Shi YH，etal.Maspin is an angiogenesis inhibitor［J］.Nat Med，2000，6(2):196-199.

［2］司徒振强，吴军正.细胞培养［M］.西安:世界图书出版社西安分公司，2004:78-88.

［3］Zou Z，Anisowicz A，Hendrix MJC，et al.Maspin，a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells［J］.Science，1994，263(5146):526-529.

［4］Boltze C.Loss ofmaspin is a helpful prognosticator in colorectalcancer.a tissue microarray analysis［J］.Pathol Res Pract，2005，200(11-12):783-790.

［5］Song SY，Son HJ，Kim MH，et a1.Prognostic significance ofmaspin expression in human gastric edenocarcinoma［J］.Hepatogsstroenterology，2007，54(75):973-976.

［6］Einhorn N，Nilsson B，Sjovall K.Factors influencing suivival in carcinoma of the ovary:Study from awell defined Ewidish population［J］.Cancer，1985，55(9):2019-2015.

［7］TropéC.Prognostic factors in ovarian cancer.Cancer Treat Res.1998，95:287-352.

［8］Puls LE，Duniho T，Hunter JE，et al.The prognostic implication of asitis in advanced ovarian cancer［J］.Gynocol Oncol，1996，61(1):109.

［9］Heighway J，Knapp T，Boyce L，et al.Expression profiling of primary non-small cell lung cancer for target identification［J］.Oncogene，2002，21(50):7749-7763.

［10］Reis-Filho JS，Milanezi F，Schmitt FC.Maspin is expressed in the nuclei of breastmyoepithelial cells［J］.JPathol，2002，197(2):272-273.

［11］Futscher BW，Oshiro MM，Wozniak RJ，etal.Role for DNAmethylation in the control of cell type specific maspin expression［J］.Nat Genet，2002，31(2)，175-179.

［12］Kohno T，MizukamiH，SuzukiM，etal.Interleukin-10mediated inhibition of angiogenesis and tumor growth in mice bearing VEGF2 producing ovarian cancer［J］.Cancer Res，2003，63(16):5091-5094.

［13］van der Bilt AR，van der Zee AG，de Vries EG，etal.Multiple VEGF family members are simultaneously expressed in ovarian cancer:a proposed model for bevacizumab resistance［J］.Curr Pharm Des，2012，18(25):3784-3792.

［14］Fernandez A，Udagawa T，Schwesinger C et al.Angiogenic Potential of Prostate Carcinoma CellsOverexpressing bcl-2［J］.JNation Cancer Institute，2001，93(3):208-213.

［15］Trisciuoglio D，Gabellini C，Desideri M，et al.Involvement of BH4 domain of bcl-2 in the regulation of HIF-1-mediated VEGF expression in hypoxic tumor cells［J］.Cell Death Differ，2011，18(6):1024-1035.

［16］Zhiqiang Z，Heidi YS，Ming Z.Targeted expression of maspin in tumor vasculartures induces endothelial cell apoptosis［J］.Oncogene，2005，24(12):2008-2019.

［17］Lee SJ，Jang H，Park C.Maspin increases Ku70 acetylation and Baxmediated cell death in cancer cells［J］.Int J Mol Med，2012，29(2):225-230.

［18］ZhangW，ShiHY，Zhang M.Maspin overexpressionmodulates tumor cell apoptosis through the regulation of Bcl-2 family proteins［J］.BMC Cancer，2005，5:50-61.