肿瘤相关M2型巨噬细胞通过Toll样受体增强卵巢癌细胞MMP-9的表达

柯 星，张淑平，吴 梦，黄 蕾，孙瑞红，黄珮珺，潘世扬，王 芳

(南京医科大学第一附属医院检验学部国家临床检验重点专科建设单位，江苏南京210029)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是最常见的女性恶性肿瘤之一，发现时常已发生侵袭转移。而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)作为一类Zn2+依赖的细胞外蛋白水解酶，它可以降解基底膜，有促进肿瘤细胞侵袭和转移的功能。近年来研究认为，MMP-9(明胶酶B/92 kDa Ⅳ型胶原酶)在多种肿瘤的发生发展，尤其是在卵巢癌细胞的侵袭转移中起重要作用［1］。已有报道认为内外源性配体可识别和激活模式分子受体——Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)，进一步活化多种信号传导途径，从而最终介导MMPs 的表达［2］。而肿瘤微环境中的巨噬细胞可受肿瘤因素诱导分化，成为M2型巨噬细胞，即肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage，TAMs)，促进肿瘤发生和演进［3］。但卵巢癌微环境中的M2 型巨噬细胞对卵巢癌细胞侵袭和转移的作用和机制目前尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌细胞系SKOV3、单核巨噬细胞系THP-1(中国科学院细胞库);RPMI 1640 培养基、McCoy's 5A 培养基、胎牛血清(Hyclone 公司);FITC 标记小鼠抗人CD206 抗体(BD 公司);兔抗人MMP-9 抗体和兔抗人MyD88 抗体(Cell signaling 公司);Toll 受体激动剂(San Diego 公司);SYBR® Premix Dimer-EraserTM(TaKaRa 公司)。

1.2 细胞培养

将THP-1 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，SKOV3 细胞置于含10%胎牛血清的McCoy's 5A 中于37 ℃、5% CO2条件培养，THP-1细胞为悬浮增殖，SKOV3 细胞为贴壁增殖，SKOV3 细胞80%汇合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数增殖期的细胞用于实验。

1.3 M2 型巨噬细胞的极化

含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基重悬THP-1 细胞至1 ×109个/L，加入佛波醇酯，调整浓度为320 nmol/L，刺激24 h 后，弃上清，PBS 充分洗涤，倒置显微镜形态学拍片，并进行后续的直接免疫荧光或共培养实验。

1.4 直接免疫荧光

盖玻片预先铺在6 孔板内，PMA 处理后THP-1细胞，4%多聚甲醛固定20 min，随后0.5% Triton X-100 透膜15 min，1% BSA 37 ℃封闭30 min，每孔按1 ∶300 加入FITC 标记小鼠抗人CD206 抗体。37 ℃避光孵育2 h，PBS 漂洗3 次。抗荧光淬灭剂封片后，小心将片子夹出，倒扣于载玻片上，倒置荧光显微镜观察并摄图。

1.5 建立共培养实验体系

M2 型巨噬细胞(1 ×106个/孔)生长于6 孔细胞培养板外室，SKOV3(5 ×105个/孔)生长于6 孔细胞培养板内室(0.4 μm 微孔)，同时设置内室为SKOV3(5 ×105个/孔)外室无M2 型巨噬细胞为对照组。每组设立3 复孔，37 ℃、5% CO2培养24 和48 h。

1.6 TLRs 激动剂刺激细胞

将SKOV3 以1 × 105个/孔培养于96 孔板，100 μL/孔，分别加入TLR1 激动剂Pam3CSK4(终浓度为1 mg/L)、TLR2 激动剂HKLM(终浓度为1011个/L)、TLR6 激动剂FSL-1(终浓度为1 mg/L)。同时设立单独SKOV3 培养无TLRs 激动剂孔为对照组，每组均设6 个复孔，37 ℃、5% CO2培养6、12和24 h。

1.7 RNA 提取及RT-PCR

以β-actin 为内参照，进行TLR1、TLR2、TLR6和MMP-9 实时荧光定量PCR 检测(ABI 7500 型)。TLR1 上游引物序列5'-GGAGGCAATGCTGCTGTT-3'，下游引物序列5'-GCCCAATATGCCTTTGTTATC CTG-3';TLR2 上游序列5'-TGTTGCAAGCAGGATCC AAAG-3'，下游序列5'-CACAAAGTATGTGGGCATTG TCCAG-3';TLR6 上游序列5'-CAGAGTGAGTGGTGC CATTACGA-3'，下游序列5'-AGCCTTCAGCTTGTGG TACTTGTTG-3';MMP-9 上游序列5'-GCTCTTCCCTG GAGACCTGA-3'，下游序列5'-CTGCCTAACCCTGG ACACCT-3';β-actin 上游序列5'-TGGCCCCAGCACA ATGAA-3'，下游序列5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTA GAAGCA-3'。PCR 反应体系和扩增程序按照说明书。根据PCR 所得CT 值应用2-△△CT法计算TLR1、2、6 和MMP-9 相对表达量。

1.8 Western blot

Transwell 小室中共培养过程后收集各组细胞，用BCA 法进行蛋白质定量。取30 μg 蛋白质/泳道加入5 ×SDS 凝胶加样缓冲液。以80 V 浓缩胶和120 V 分离胶电泳分离细胞蛋白质，转膜1 h 50 min。室温封闭2 h 后，4 ℃摇床一抗孵育过夜;TBST 洗膜10 min×3 次;摇床上二抗室温孵育2 h;TBST 洗膜10 min×3 次。用DAB-HRP 荧光检测试剂激发荧光，GAPDH 蛋白为内参照，于暗室显影和定影后进行图像分析。

1.9 统计学分析

采用SPSS16.0 进行分析。正态分布数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验。

2 结果

2.1 PMA 刺激前后THP-1 形态变化

通常未经诱导的THP-1 细胞多呈悬浮生长，多为圆形。图1 显示在320 nmol/L PMA 诱导分化12和24 h 后，细胞形态变为多边形，细胞表面可伸出伪足，胞质内偶见空泡，细胞体积明显增大，24 h 较12 h的刺激时间，THP-1 的极化现象更加明显。

图1 PMA 刺激后THP-1 形态变化Fig 1 THP-1 morphological changes after PMA stimulation (×200)

2.2 THP-1 诱导分化后表面分子标志的改变

PMA 诱导后细胞膜表面有较高的荧光强度，CD206 表达阳性(图2A，B)，认为THP-1 细胞向M2型巨噬细胞方向分化。而未经PMA 诱导的THP-1细胞表面CD206 无表达或低表达(图2C，D)。

图2 THP-1 诱导分化后直接免疫荧光表面CD206 的表达Fig 2 Detecting CD206 expression by direct immunofluorescence (×200)

2.3 共培养体系对SKOV3 中MMP-9 表达水平影响

与M2 型巨噬细胞共培养24 和48 h 的SKOV3中MMP-9 mRNA 水平明显高于SKOV3 单独培养组(P＜0.05)(图3)。24 和48 h 共培养组中SKOV3的MMP-9 蛋白表达水平较SKOV3 单独培养组也明显提高(图4)。

图3 共培养体系对SKOV3 中MMP-9 mRNA表达水平影响Fig 3 Level changes of MMP-9 mRNA in co-culture system

图4 共培养体系对SKOV3 中MMP-9 蛋白水平的影响Fig 4 Level changes of MMP-9 protein in co-culture system

2.4 共培养体系对SKOV3 中TLRs 表达水平影响

共培养24 h 后，TLR1、TLR2 和TLR6 mRNA 表达水平显著高于SKOV3 单独培养组(P＜0.05)(图5A)，而共培养48 h 后，共培养组中SKOV3 的TLR1、TLR2 和TLR6 mRNA 表达水平也高于SKOV3 单独培养组(P＜0.05)(图5B)。

2.5 共培养体系对SKOV3 中TLRs 信号通路蛋白表达影响

与M2 型巨噬细胞共培养24 和48 h 的SKOV3中TLRs 信号通路蛋白MyD88、TRAF6 和P-NF-κB表达水平显著高于SKOV3 单独培养组(图6)。

2.6 TLRs 刺激SKOV3 对MMP-9 的影响

图7 显示Pam3CSK4 刺激SKOV3 6 h 后，MMP-9 mRNA 水平开始升高，12 和24 h 表达高于SKOV3 单独培养组(P＜0.05);然而HKLM 刺激6 h 后，MMP-9 mRNA 水平升高不明显，但12 和24 h MMP-9 较SKOV3单独培养组升高(P＜0.05);FSL-1 刺激6、12 和24 h 后，MMP-9 mRNA 水平高于SKOV3 单独培养组(P＜0.05)。

图5 共培养体系对SKOV3 中TLRs 表达水平的影响Fig 5 Level changes of TLRs mRNA in co-culture system

图6 共培养体系对SKOV3 中TLRs 信号通路蛋白表达的影响Fig 6 Level changes of TLRs signaling pathway proteins in co-culture system

3 讨论

卵巢癌(OC)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病隐匿，70%～80%患者确诊时已到晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)［4］。基质金属蛋白酶(MMPs)是能够降解基底膜和细胞外基质的主要成分，而MMP-9主要降解细胞外基质中Ⅳ型胶原，从而破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，促进细胞转移［5-6］。已有文献明确报道，MMP-9 表达升高与卵巢癌恶性程度呈相关性［7］。

图7 TLR1、2、6 激动剂作用SKOV3 对MMP-9 的影响Fig 7 Effects of TLR1，2 and 6 agonist to MMP-9 mRNA in SKOV3

近十多年来，发现巨噬细胞在各种刺激剂的作用下，可具有不同的活化状态，并在不同的微环境中发挥不同的作用［8］。多位学者认为在肿瘤内巨噬细胞有向M2 型转化的趋势，即肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，能表达高水平的CD206 和IL-10，可抑制T 细胞增殖，参与了肿瘤的进展过程。认为M2 型巨噬细胞对卵巢癌内皮细胞血管生成及肿瘤进展发挥作用［9］。但M2 型巨噬细胞对卵巢癌侵袭转移的作用及具体机制并不清楚。

本实验建立M2 型巨噬细胞和卵巢癌细胞系SKOV3 的共培养系统，24 和48 h 后发现SKOV3 中MMP-9 表达水平明显高于SKOV3 单独培养组。提示M2 型巨噬细胞在卵巢癌生长微环境中可诱导上调MMP-9 的表达，增强卵巢癌的侵袭和转移。M2型巨噬细胞上调MMP-9 的机制如何?TLRs 是否可能参与这一过程?TLRs 是近年研究较多的跨膜模式识别受体，不仅表达于免疫细胞［10］，在人类肿瘤及肿瘤细胞系同样有表达，可能参与肿瘤的发展演进过程［11］。TLR1、TLR2 和TLR6 是介导炎性反应的主要受体，TLRs 活化后，在MyD88 依赖性信号途径中，可使IRAK 发生磷酸化改变，进一步促使TRAF6 寡聚化。由活化后的TRAF6 和TAK1 介导活化IKKs，引起IκB 降解，导致NF-κB 亚单位的释放并转移至核内启动各种基因转录［12］。近来发现TLRs 与肿瘤发展的行为学密切相关。本研究结果显示共培养后的SKOV3 可高表达TLR1、2 和6，TLRs 信号通路蛋白MyD88、TRAF6 和P-NF-κB 表达水平也明显提高，提示M2 型巨噬细胞的共培养环境中，某些因素可活化卵巢癌细胞TLRs。国外也有类似研究，结肠癌TLR9 可以通过激活NF-κB 通路来促进直肠癌细胞LS174 和SW620 发生侵袭［13］，在黑色素瘤细胞的侵袭转移是与细胞内TLR4 的活化和NF-κB 通路介导［14］。提示TLRs 在肿瘤细胞上的高表达和活化，可能发挥了一定生物学功能。

为了探究TLRs 信号通路活化与MMP-9 表达的关系，发现使用TLR1、2 和6 相应激动剂作用后的SKOV3 表现出MMP-9 的表达增强，而TLR1、2 和6通路活化与MMP-9 表达上调有关，此结果从侧面提示M2 型巨噬细胞可以刺激和活化卵巢癌细胞的TLR1、TLR2 和TLR6 信号通路，使得基质金属蛋白酶MMP-9 表达增高，MMP-9 可降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质，促进卵巢癌侵袭转移的过程。但其具体的作用机制有待进一步探索。

综上所述，本研究发现M2 型巨噬细胞可通过某种机制，刺激卵巢癌细胞TLR1、TLR2 和TLR6表达上调，使TLRs 信号通路活化，进一步促使MMP-9 表达增加，可能与卵巢癌侵袭生长的生物学行为有关。M2 型巨噬细胞及TLRs 介导的信号传导通路在卵巢癌发生、发展中的作用，能为TAM与卵巢癌及其相互关系的发病机制研究提供了新的思路。

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