Notch和HES蛋白表达在大鼠静脉桥狭窄中的作用

魏小栋，肖永光

(1.湖北民族学院附属民大医院心胸外科，湖北恩施445000;2.武汉大学人民医院胸外科，湖北武汉430062)

自体静脉因其取材方便、操作相对简单，常作为外科治疗冠心病和外周动脉狭窄的首选材料。但此类手术后静脉桥远期疗效不佳，5年通畅率仅为30%，导致远端血供重新受到影响，严重者甚至需要再次手术治疗［1］。研究表明，影响术后静脉桥再次狭窄的主要原因是中层血管平滑肌细胞的大量增生并分泌大量的细胞基质在管壁堆积，造成管壁增厚、弹性减弱［2］。但血管平滑肌细胞增生和分泌大量细胞基质的病理机制目前却尚不清楚［3］。

Notch 是一个非常保守的信号通路，其一共有4个受体(Notch1、2、3、4)和5 个配体(Jagged1、2 和Dll1、3、4)，γ-促分泌酶复合体DAPT 酶切释放Notch 受体的活化形式NICD 和HES1。有研究表明Notch 通路在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，vSMCs)的增生/凋亡以及细胞表型变化过程中起到重要作用［4］。但Notch 信号在静脉桥狭窄中的作用目前尚不清楚，本研究探讨Notch 信号在静脉桥狭窄中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验模型的建立与分组

SPA 级SD 大鼠，体质量220～240 g，雌雄不限。共30 只(武汉大学实验中心)，随机分为对照组(control)、实验组和安慰剂组，每组10 只。各组实验动物均建立静脉桥移植模型，从尾静脉注射4%戊巴比妥钠(30 mg/kg)+肝素(1.5 mg/kg)。麻醉诱导成功后，左颈部备皮并切开颈部皮肤，游离左侧颈总动脉和颈外静脉。在25 倍手术显微镜下，剪取长约1 cm 静脉作为血管桥，用11-0 医用无损伤线将动脉两端分别与静脉桥行端端吻合［5］。术毕依层缝合，关闭切口。术后置大鼠于室温，自然清醒。术毕每日触摸颈部，静脉桥处可及震颤。对照组术后不做任何处理;实验组(DAPT 组)每只每日皮下注射DAPT 10 mg/kg;安慰剂组(DMSO 组)注射安慰剂二甲基亚砜(DMSO)10 mg/kg。术后3 组动物均常规饲养。实验所有试剂均来自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 标本采集和处理

术后组动物常规饲养，手术当天及术后第7、14、21 及28 天随机抽取3 组动物各2 只，用上述相同方法麻醉后沿原切口切开，游离静脉桥，清除静脉壁外附着组织，阻断两端吻合处，向腔内注入适量10%甲醛液，10 min 后切取移植静脉桥进行常规病理切片，HE 染色及PCNA 免疫组化染色。实验动物均放血处死。

1.3 观察指标

术后28d 收集齐各组移植静脉后观察以下指标:在显微镜下，以内弹力膜为界，测量10 mm 长静脉桥中膜平均厚度;计算静脉桥中膜平滑肌细胞系PCNA 染色阳性指数(PCNA 指数= PCNA 阳性细胞/视野下100 个细胞×100%);取移植血管，裂解细胞制成蛋白液后，行Western blot，分析Notch1 和HES1 的蛋白浓度变化。

1.4 统计学分析

采用spss17.0 软件进行统计分析。定量数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较用t 检验。

2 结果

2.1 Notch 信号蛋白在静脉桥中呈高表达状态

Notch1，HES1 蛋白在静脉移植中呈高表达，且随着时间的延长，这些蛋白表达逐渐增加(图1)。HES1 蛋白的表达与静脉狭窄的严重程度呈正相关(图2)。

图1 WB 显示相关蛋白表达变化Fig 1 WB data show the result of Notch1 and HES1

图2 HES1 蛋白表达与移植静脉中膜厚度相关性Fig 2 The expression of HES1 protein and intima thickness of vein graft

2.2 抑制Notch 信号能够缓解静脉桥狭窄

DAPT 能够明显抑制HES1 蛋白的表达(图3)，而安慰剂组中DMSO 对Notch 信号通路无影响，所以HES1 蛋白表达无变化。图4 显示各组移植静脉后静脉管壁厚度的差异。图5 显示DAPT 组中层厚度比例明显低于对照组和DMSO 组(P＜0.05)，PCNA 指数显示DAPT 组明显低于其他两组(P＜0.05)(图6)。

图3 各组移植静脉vSMCs 中HES1 蛋白表达Fig 3 The expression of HES1 protein in each group

图4 各组移植静脉HE 染色Fig 4 H＆E staining in each group

图5 各组移植静脉中膜厚度比变化Fig 5 The intima thickness of vein graft in each group

3 讨论

静脉是用于治疗冠心病和外周动脉狭窄最常用的自体材料，但静脉桥再狭窄一直是制约其远期疗效的关键因素［6］。虽然静脉桥狭窄的原因目前尚未完全明了，有研究表明静脉桥发生狭窄的主要原因是血管壁中膜平滑肌样细胞增生且细胞表型发生变化，并分泌大量细胞外基质在血管壁内堆积，从而形成移植桥血管管腔狭窄，导致闭塞［5］。本实验也证实如果降低中膜平滑肌细胞的增殖能力，可以极大限度的缓解静脉桥狭窄的程度。

图6 各组移植静脉PCNA 指数变化Fig 6 PCNA positive index of vein graft in each group

Notch 信号是一个相对保守的通路，其在血管系统的生理和病理反应中均起到重要作用，特别是在调控血管平滑肌细胞增生方面起到重要作用［3，7］。本实验证实静脉桥狭窄过程中，Notch 信号通路明显活化，其蛋白成员均呈高表达状态，且与静脉桥狭窄程度呈正相关，这说明Notch 信号与静脉桥狭窄存在一定的相关性。而通过DAPT 阻断Notch 信号通路，不仅可以使Notch 信号通路的蛋白表达下降，而且可以明显抑制肺动脉高压的形成。本实验结果还显示血管平滑肌细胞PCNA 阳性指数明显降低，提示血管平滑肌细胞增生程度明显被抑制，表明DAPT 能够通过阻断notch 通路，影响血管平滑肌细胞的增生，从而达到抑制静脉桥内膜增厚的目的［8］。

［1］Hillis LD，Smith PK，Anderson JL，et al.2011 ACCF/AHA Guideline for coronary artery bypass graft surgery:executive summary:a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines［J］.Circulation，2011，124:2610-2642.

［2］Serruys PW，Morice MC，Kappetein AP，et al.Percutaneous coronary intervention versus coronary-artery bypass grafting for severe coronary artery disease［J］.N Engl J Med，2009，360:961-972.

［3］Kudo FA，Muto A，Maloney SP，et al.Venous identity is lost but arterial identity is not gained during vein graft adaptation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27:1562-1571.

［4］Chen Y，Zheng S，Qi D，et al.Inhibition of Notch signaling by a c-secretase inhibitor attenuates hepatic fibrosis in rats［J］.PloS One，2012，7:e46512

［5］Sun J，Zheng J，Ling KH，et al.Preventing intimal thickening of vein grafts in vein artery bypass using STAT-3 siRNA［J］.J Transl Med，2012，10:2-3.

［6］Bikdeli B，Hassantash SA，Pourabdollah M，et al.Histopathologic insight into saphenous vein bypassgraft disease［J］.Cardiology，2012，123:208-215.

［7］Muto A，Model L，Ziegler K，et al.Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation:insights into the neointimal algorithm and management strategies［J］.Circ J，2010，74:1501-1512.

［8］Lyon CA，Koutsouki E，Aguilera CM，et al.Inhibition of N-cadherin retards smooth muscle cell migration and intimal thickening via induction of apoptosis［J］.J Vasc Surg，2010，52:1301-1309.