ADAM33在IL-4刺激的人气道平滑肌细胞中对NF-κB和TGF-β1表达的影响

陶 韬，朱小华，古嫦英，张孝彬，郭 武，廖秀清

(重庆市涪陵中心医院呼吸内科，重庆408000)

哮喘的病因复杂，受遗传和环境因素的双重影响，以气道高反应性和气道重塑为特点，多种细胞、炎性介质和细胞因子参与其发生发展过程，但其发病机制仍不完全清楚。在气道重塑过程中气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)增生、肥大，导致气流阻塞、持续气道高反应性，因此，研究ASMCs 增殖的细胞内信号传导通路对完善哮喘发病机制有重要意义。哮喘以Th2 型免疫反应为主，而白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)是主要的Th2 型细胞因子［1-3］。解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloprotease，ADAM33)的多态性与哮喘的严重程度、易感性、气道高反应性和气道重塑等相关［1，3-7］。转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)是气道重塑的重要细胞因子，可刺激气道和血管平滑肌细胞增生和肥大［2，8］。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一种核转录因子，参与多种基因的转录和表达，与哮喘也密切相关［9］。本课题组前期研究发现，IL-4 可引起HASMCs 中ADAM33 表达增高，并呈浓度依耐性，故本研究以浓度为50μg/L 的IL-4 刺激ASMCs，初步探讨ADAM33 在人气道平滑肌细胞IL-4/NF-κB/TGF-β1 信号通路中的作用，为进一步完善哮喘的发病机制和防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人气道平滑肌细胞HASMCs(上海众华生物科技有限公司)，人IL-4(PeproTech 公司)，RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gibco 公司)，Lipofectamin RNAiMAX Reagent 试剂盒(Invitrogen 公司)，RNA提取试剂盒(Omega 公司)，Primscript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒和SYBR Premix ExⅡTaq荧光定量 PCR 试剂盒(TaKaRa 公司)，兔抗ADAM33抗体(Gene Tex 公司)，兔抗TGF-β1 抗体(Bioworld 公司)，兔抗NF-κB p65 抗体和兔抗GAPDH抗体(Immunoway 公司);蛋白定量试剂盒(Pierce 公司)，蛋白印迹发光液和PVDF 膜(Millipore 公司)，余Western blot 相关的试剂(碧云天公司);引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)，ADAM33-siRNA 由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成(表2)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人气道平滑肌细胞HASMCs 用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞处于增殖对数期时消化细胞，每孔加入1 ×105个细胞接种于6 孔板中，共2.5 mL，6 h 后加入50 μg/L 的IL-4 刺激HASMCs，以未刺激细胞组为对照，24 h 后提取RNA 和蛋白。

1.2.2 细胞转染:50 μg/L 的IL-4 刺激HASMCs 24 h 后进行瞬时转染，采用RNAi MAX 脂质体转染法，设干扰组、阴性对照组和空白对照组，Opti-MEM 500 μL、siRNA 1.5 μL、RNAi MAX 5 μL 混匀，室温静止20 min 后加入各孔，48 h 后提取RNA 和蛋白。

表1 实验所用引物Table 1 The primers used in the experiment

表2 ADAM33 干扰RNA 序列Table 2 ADAM33 interfering RNA sequences

1.2.3 RNA 抽提:IL-4 刺激HASMCs 48 h 和转染48 h 后提取RNA，RNA 提取按试剂盒说明书进行，1%琼脂糖凝胶电泳，分光光度计检测浓度和纯度。

1.2.4 反转录反应:去除基因组DNA 反应:5 ×去基因组DNA 缓冲液2.0 μL，DNA 酶1.0 μL，RNA 1 μg，去RNA 酶的去离子水加到10 μL 体系，条件为42 ℃2 min;反转录反应:去除基因组DNA 反应液，反转录酶混合物Ⅰ1 μL，反转录随机引物预混物1 μL，5 ×反转录引物缓冲液Ⅱ4 μL，去RNA 酶的去离子水4 μL，总反应体积为20 μL，反转录条件为37 ℃15 min，85 ℃5 s。

1.2.5 实时定量PCR 法检测IL-4 对人气道平滑肌细胞ADAM33 mRNA 表达的影响:将反转录产物cDNA 稀释10 倍后进行荧光定量PCR，扩增体系按说明书进行，扩增条件:预变性95 ℃10 min 后，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共40 循环。插入溶解曲线。每个样本设3 个复孔。

1.2.6 Western blot 法检测IL-4 对人气道平滑肌细胞ADAM33 蛋白表达的影响:IL-4 刺激HASMCs 48 h后，常规方法提取细胞总蛋白，取蛋白提取物50 μg，100 ℃变性5 min 后在8%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，在80 V 恒压下浓缩30 min，100 V 恒压下分离90 min，切胶，在250 mA电流下转膜90 min，封闭2 h，兔抗ADAM33(1∶500稀释)4 ℃过夜，TBST 洗10 min×3，与二抗在室温下反应1.5 h，三乙醇胺缓冲液吐温－20 洗10 min ×3，ECL 法发光，同时以GAPDH(1∶800 稀释)为对照。凝胶成像仪采集图像，Quantity One 软件测量灰度值，目的蛋白吸光度值与内参吸光度值的比值即为目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 实时定量PCR 法和Western blot 法检测ADAM33-siRNA 对人气道平滑肌细胞ADAM33 的抑制率:IL-4 刺激HASMCs 24 h 后瞬时转染ADAM33-siRNA-575，48 h 后提取RNA 和蛋白，实时定量PCR 法和Western blot 法检测抑制率，步骤同前。

1.2.8 实时定量PCR 法检测沉默人气道平滑肌细胞ADAM33 后对TGF-β1、NF-κB mRNA 表达的影响:沉默人气道平滑肌细胞ADAM33 后实时定量PCR 法检测TGF-β1 和NF-κB mRNA 的表达情况，扩增体系和扩增条件同前。

1.2.9 Western blot 法检测沉默人气道平滑肌细胞ADAM33 后对TGF-β1、NF-κB 蛋白表达的影响:瞬时转染ADAM33-siRNA-575 48 h 后提取蛋白，取蛋白提取物50 μg 进行SDS-PAGE 电泳，在80 V 恒压下浓缩30 min，100 V 恒压下分离90 min，切胶，在250 mA 电流下，TGF-β1 转膜45 min，NF-κB 转膜70 min，封闭2 h，兔抗TGF-β1、NF-κB P65(均1∶500稀释)4 ℃过夜，三乙醇胺缓冲液吐温－20 ℃洗10 min ×3，与二抗在室温下反应1.5 h，TBST 洗10 min×3，ECL 法显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计学软件包分析，ADAM33、TGF-β1、NF-κB mRNA 和蛋白采用均数± 标准差(±s)表示，两组间的比较采用t 检验。

2 结果

2.1 IL-4 对人气道平滑肌细胞ADAM33 mRNA表达的影响

用IL-4 刺激HASMCs 24 h 后，刺激组ADAM33 mRNA 的相对表达量为4.415 ±0.610 显著高于未刺激组的1.012 ±0.193(P＜0.05)。

2.2 IL-4 对人气道平滑肌细胞ADAM33 蛋白表达的影响

用IL-4 刺激HASMCs 24 h 后，刺激组ADAM33蛋白的相对表达量为0.695 ±0.007，显著高于未刺激组的0.210 ±0.018(P＜0.05)(图1)。

图1 IL-4 对人气道平滑肌细胞ADAM33 蛋白表达的影响Fig 1 The effct of IL-4 on the expression of ADAM33 protein in human airway smooth muscle cells

2.3 ADAM33-siRNA 对人气道平滑肌细胞ADAM33 的抑制作用

转染48 h 后，干扰组组、阴性对照组和空白对照组ADAM33 mRNA 的表达量分别为0.193 ±0.046、1.02 ±0.241 和1.054 ±0.147，干扰组与阴性对照组相比表达下调约81.08%(P＜0.05);干扰组ADAM33 蛋白的表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);空白对照组和阴性对照组在mRNA 水平和蛋白水平差异无统计学意义(图2)。

2.4 沉默人气道平滑肌细胞ADAM33 后对TGF-β1、NF-κB mRNA 表达的影响

图2 ADAM33-siRNA 对人气道平滑肌细胞ADAM33 蛋白表达的影响Fig 2 The effct of ADAM33-siRNA on the expression of ADAM33 protein in human airway smooth muscle cells

沉默人气道平滑肌细胞ADAM33 后，干扰组、阴性对照组和空白对照组TGF-β1 mRNA 的表达量分别为0.602 ± 0.024、1.01 ± 0.176 和1.239 ±0.171，NF-κB mRNA 的表达量分别为0.54 ±0.08、1.014 ±0.21 和1.049 ±0.378。与空白对照组和阴性对照组相比较，干扰组TGF-β1 mRNA 和NF-κB mRNA 表达下降(P＜0.05)，空白对照组和阴性对照组间的差异无统计学意义。

2.5 沉默人气道平滑肌细胞ADAM33 后对TGF-β1、NF-κB 蛋白表达的影响

干扰组、阴性对照组、空白对照组TGF-β1 蛋白的表达量分别为0.227 ±0.016、0.7 ±0.048、0.715 ±0.025，NF-κB 蛋白的表达量分别为0.335 ±0.048、0.922 ±0.04、0.943 ±0.046。与空白对照组和阴性对照组相比较，干扰组TGF-β1 蛋白和NF-κB 蛋白表达下降(P＜0.05)，空白对照组和阴性对照组间的差异无统计学意义(图3)。

图3 ADAM33 对人气道平滑肌细胞TGF-β1 和NF-κB 蛋白表达的影响Fig 3 The effect of ADAM33 on the expression of TGF-β1 and NF-κB protein in human airway smooth muscle cells

3 讨论

哮喘是以气道高反应性和气道重塑为特点的慢性气道非特异性炎性反应疾病，多种细胞(包括平滑肌细胞)、炎性介质和细胞因子参与其发生发展过程，其发病机制仍不完全清楚，对平滑肌细胞的保护可能会成为防治哮喘的主要方向。研究表明哮喘患者IL-4 高表达，并与上皮-间质转化相关［1-3］。以不同浓度的IL-4 或/和IL-13 刺激人肺成纤维细胞MRC-5，能促进ADAM33 的表达，并呈浓度依耐性和时间依赖性［10］。本实验组前期研究也发现，IL-4 可导致HASMCs 中ADAM33 表达增高，并呈浓度依耐性，提示IL-4 和ADAM33 在气道重塑过程中可能起着重要的作用，故本实验后继研究以50 μg/L 的IL-4 为刺激浓度，本研究发现50 μg/L 的IL-4 刺激HASMCs 24 h 后，在mRNA 水平和蛋白水平，均明显上调了ADAM33 的表达，表明细胞因子IL-4 可促进ADAM33 的表达。

ADAM33 基因可能与哮喘有关，主要表达在肺成纤维细胞和支气管的平滑肌细胞，而在上皮细胞和T 细胞中无表达［4］。但亦有研究表明ADAM33还表达于气道上皮细胞［5，11］。大多研究结果表明ADAM33 的多态性与哮喘相关［1，3-7］，但亦有研究表明与哮喘的严重程度无关［5，12］。在不同地区、不同种族人群中，SNPs 分布也不完全相同［6］，故需要大量研究来验证ADAM33 在哮喘的作用。由于ADAM33很可能介导了气道重塑，研究其机制并针对此基因的治疗有望为哮喘患者带来最大利益。

TGF-β1 是气道重塑的重要细胞因子，与气道基底膜厚度和哮喘的严重程度呈正相关［2，8］，前期研究也发现IL-4 可引起HASMCs 中TGF-β1 的表达上调。但有研究表明TGF-β1 可抑制炎性介质的表达，故TGF-β1 能否作为哮喘病情分级、疗效和评价预后的可靠指标，尚需大量的研究。IL-4 与TGF-β1在诱导上皮间质转换过程中具有协同作用［2］，TGF-β2可诱导支气管成纤维细胞ADAM33 胞外域的脱落［9］，而ADAM33 的金属蛋白酶活性可促使膜结合的生长因子(如EGF、TGF、IGF)及其受体释放，成为可溶性形式，刺激气道间质细胞的增殖和分化，表明三者之间存在一定的关系。而本研究发现在干扰ADAM33 后，TGF-β1 的表达量也下降，表明他们之间可能存在正负反馈机制或信号级联放大效应，两者之间的关系尚需进一步研究。

NF-κB 参与基因的转录，调控多种细胞因子、黏附分子、趋化因子、炎性介质等基因的转录［13］。NF-κB调控的炎性蛋白囊括了绝大多数介导哮喘的炎性蛋白，它的活化不仅通过诱导这些炎性蛋白的表达参与哮喘的气道慢性炎性反应，而且还通过其正反馈环路导致炎性反应过程的放大。本研究发现NF-κB 在平滑肌细胞中的表达也与ADAM33 相关，抑制ADAM33 表达后，NF-κB 的表达也降低，表明NF-κB 可能是ADAM33 下游的一个重要信号分子。

综上所述，哮喘治疗中最大的问题是气道重塑，目前还没有针对气道重塑的有效治疗手段，气道平滑肌细胞的增殖在哮喘气道重塑中起着重要的作用，而本研究发现ADAM33 可能是IL-4 调节人气道平滑肌细胞NF-κB/TGF-β1 信号通路中的一个关键信号分子，故有望成为防治哮喘的重要靶点。

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