HCV LNAzyme对病毒5'非编码区基因调控的特异性抑制作用

邓益斌，农乐根，梁祚仁，张 梁，覃羽华，何 平

(右江民族医学院附属医院医学检验中心，广西百色533000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是单股正链RNA 病毒，含5'非编码区、结构区(C、E 区)、非结构区(NS 区)、和3'非编码区，其中，5'非编码区是丙型肝炎病毒复制所必需的元件，是HCV 十分保守的序列之一，其内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)在病毒基因表达调控中发挥着重要的作用，是病毒基因组中唯一的一个翻译起始位点。因此，推测切割破坏该位点RNA 序列可能有效阻断病毒的基因表达。锁核酸核酶(LNAzyme)是在脱氧核酶的2 条结合臂上引入1 个或多个锁核酸单体构建而成的新型核酸酶，与其他核酸酶相比，具有更强的分子杂交能力、更高的酶切活性和切割效率［1-4］。因此，在前期研究基础上［5-7］，进一步针对HCV 5'非编码区IRES 位点的AUG 起始密码子设计合成LNAzyme，两侧臂长约18～19 nt，环结构由GGCTAGCTACAACGA 碱基组成，以阳离子脂质体介导转染HepG2.9706 细胞系，观察其对病毒复制与表达的抑制作用，以期为抗HCV 治疗寻找专一、高效的新型分子药物。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2.9706 细胞是一种转染有丙型肝炎病毒5'-NCR/C 基因并稳定表达的HepG2 细胞，含荧光素酶基因(中国人民解放军广州军区空军医院刘光泽博士惠赠)，本室常规培养于含G418(380 ITI1)、10%胎牛血清的DMEM 培养基中，37 ℃、5% CO2条件下5～6 d 传代1 次;DMEM 培养基、G418 和Trizol RNA 提取试剂盒等(Gibco 公司);胎牛血清(杭州四季清公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);荧光定量PCR 检测HCV RNA 试剂盒(深圳匹基公司);化学发光试剂盒(Bright-GloTM荧光素酶分析系统)(Promega 公司)。

1.2 方法

1.2.1 核酶分子设计与合成:针对HCV 5'-NCR 区IRES 位点分别设计以下几段序列:1)脱氧核酶:5'-GACTGCTAGCGGCTAGCTACAACGACGAGTAGTGTC-3';2)硫代脱氧核酶:5'-GSASCSTSGSCTAGCGGCT AGCTACAACGACGAGTAGSTSGSTSCS-3'，即在DNAzyme 基础上对5'端前5 个碱基及3'端前5 个碱基进行硫代修饰，以上标“S”表示;3)锁核酸核酶:5'-GALCTLGCTAGCGGCTAGCTACAACGACGAGTALGT GTLC-3'，即在DNAzyme 的2 个结合臂碱基A 或T分别引入2 个LNA 单体，以上标“L”表示;4)无关脱氧核酶:5'-TCCAGAGGAAGGGCTAGCTACAACG ATTGCATACAGC-3'。其中，GGCTAGCTACAACGA为脱氧核酶的催化活性序列，其2 侧为靶位特异性识别序列。以上各序列经BLAST 排除与人同源后由美国GENELINK 公司合成修饰。

1.2.2 实验分组与脂质体转染:对照组包括空白对照组(blank control)、脂质体对照组(lipo-control)和无关锁核酸核酶对照组(U-LNAzyme control)。实验组包括脱氧核酶(DNAzyme)、硫代脱氧核酶组(SDNAzyme)和锁核酸核组 (LNAzyme )。 将HepG22.9706 细胞按1 ×105个/mL 接种于16 孔培养板，每孔100 μL，共设定6 个组，每组各设6 个复孔，待细胞贴壁后吸取培养上清液(－20 ℃保存)，分别在各组每孔中1 次性加入含核酶量为10 μmol/L的DMEM 混合液1 mL，分别于24、48 和96 h 收集各孔培养上清液500 μL，保存于－20 ℃待测。脂质体转染严格按说明书操作。

1.2.3 培养上清液HCV RNA 含量检测:采用荧光定量PCR 试剂盒法。1)在预先准备好的1.5 mL灭菌离心管中加入RNA 酶抑制剂20 μL，然后分别加入待测液，阴、阳性对照和标准品各100 μL，再加入裂解液100 μL，振荡混匀。2)将上述混合液全部转移至核酸提取柱中，开启负压装置，抽干液体，然后分别用洗涤液A 和B 液各500 μL，各洗涤1 次，抽干。3)关闭负压装置，将提取柱转入2 mL 离心管中，15 000 r/min，离心1 min。4)将提取转入新2 mL离心管中，加入50 μL 洗脱液，静置1 min，10 000 r/min，离心1 min，取12.5 μL 洗脱液加样，余下步骤和PCR 扩增条件严格按说明书操作。结果采用计算对数平均值的方法获得cDNA 平均拷贝数。

1.2.4 培养细胞内荧光蛋白表达检测:分别于基因转染后24、48 和96 h 终止培养，将培养板平衡至室温，向每孔中加入经室温平衡后的荧光素酶发光试剂100μL，轻轻摇匀2 min 以使细胞完全裂解，立即应用VictorTMWallac 1420 多标记检测仪检测1 s 发光强度，输出值以CPS 表示。

1.2.5 荧光显微镜系统观察细胞荧光蛋白表达:培养细胞转染96 h 后，用倒置荧光显微镜系统在488 nm激发波长下观察绿色荧光的表达情况并拍照，每次观察5 个不同视野，取均值，结果以表达率(%)表示(表达率=a/A ×100%，其中，A 为普通光下计数细胞得数，a 为荧光下相同视野计数荧光细胞得数)。

1.2.6 LNAzyme 对细胞的毒性检测:采用MTT 比色法检测LNAzyme 对细胞活性的影响。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LNAzyme 对HCV RNA 复制的抑制

加入药物后，各实验组对HCV RNA 的复制均显示出较强的抑制作用(P＜0.05)，其中，LNAzyme组的抑制作用最强，平均抑制率为48.02%。与用药前比较，HCV RNA 的复制量也明显下降(P＜0.05)，96 h 后，LNAzyme 组的平均下降率达81.21%(表1)。

2.2 LNAzyme 对培养细胞荧光素酶基因表达的抑制

加入药物后，各实验组对细胞荧光素酶基因的表达均显示出较强的抑制作用(P＜0.05)，其中，LNAzyme 组的抑制作用最强，平均抑制率为53.05%。与用药前比较，HCV RNA 的表达量也明显下降(P＜0.05)，96 h 后，LNAzyme 组的平均下降率达84.25%(表2)。

2.3 LNAzyme 对细胞荧光蛋白表达抑制情况

转染96 h 后，荧光显微镜下观察发现，表达绿色荧光蛋白的细胞数，LNAzyme 组(25% ±16%)明显少于DNAzyme (82% ±26%)、S-DNAzyme(76%±30%)和对照组(85% ±30%)(图1)。

表1 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞HCV RNA 复制的影响Table 1 The inhibitory effect of LNAzyme on replication of HCV RNA in hepG2.9706 cells(±s，×105 copies/mL，n=6)

表1 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞HCV RNA 复制的影响Table 1 The inhibitory effect of LNAzyme on replication of HCV RNA in hepG2.9706 cells(±s，×105 copies/mL，n=6)

＊P＜0.05 compared with control groups;△P＜0.05 compared with DNAzyme group;#P＜0.05 compared with S-DNAzyme group;▲P＜0.05 compared with before transfection.

group0 hour24 hours48 hours96 hours blank control group1.52 ±0.441.55 ±0.471.61±0.521.65 ±0.44 lipo-control group1.62 ±0.451.58 ±0.461.67 ±0.441.65 ±0.43 U-LNAzyme control group1.55 ±0.451.57 ±0.431.62 ±0.481.68 ±0.42 DNAzyme group1.65 ±0.581.23 ±0.491.02 ±0.550.83 ±0.53 S-DNAzyme group1.62 ±0.481.02 ±0.530.81 ±0.580.75 ±0.42 LNAzyme group1.65 ±0.440.83 ±0.310.50 ±0.220.31 ±0.15＊△#▲

表2 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞荧光素酶基因表达的影响Table 2 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase in hepG2.9706 cells(±s，×104 CPS，n=6)

表2 LNAzyme 对HepG2.9706 细胞荧光素酶基因表达的影响Table 2 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase in hepG2.9706 cells(±s，×104 CPS，n=6)

＊P＜0.05 compared with control groups;△P＜0.05 compared with DNAzyme group;#P＜0.05 compared with S-DNAzyme group;▲P＜0.05 compared with before transfection.

group0 hour24 hours48 hours96 hours blank control group4.97 ±2.924.95 ±2.894.96±2.814.97 ±2.79 lipo-control group4.89 ±2.914.91 ±2.854.89 ±2.754.91 ±2.87 U-LNAzyme control group4.93 ±2.884.89 ±2.784.91 ±2.834.89 ±2.78 DNAzyme group4.87 ±2.663.57 ±2.663.02 ±2.692.41 ±2.44 S-DNAzyme group4.91 ±2.873.04 ±2.612.44 ±2.152.21 ±1.88 LNAzyme group4.89 ±2.452.01 ±1.521.65 ±1.230.77 ±0.25＊△#▲

图1 LNAzyme 对细胞荧光蛋白表达的抑制作用Fig 1 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase(×100)

2.4 LNAzyme 对细胞活性的影响

用药前和用药后24h、48h 和96 h，LNAzyme 组的MTT 比色A 值分别为1.22 ±0.05、1.18 ±0.04、1.24 ±0.05 和1.15 ±0.04，与空白对照组的1.37 ±0.04 均无差异，表明锁核酸脂质体混合物对细胞活性基本无影响。

3 讨论

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是单股正链RNA 病毒，属黄病毒属。HCV 基因组RNA 由约9400 核苷酸(nt)组成，含5'非编码区、结构区(C、E区)、非结构区(NS 区)、和3'非编码区，其中，5'非编码区是丙型肝炎病毒复制所必需的元件，其内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)是病毒基因组中唯一的一个翻译起始位点，在病毒基因表达调控中发挥着重要的作用。虽然HCV 有多种基因型，各型间的基因序列有差异，但在IRES 位点AUG 起始密码子上下游约20nt 的序列，在各型HCV间却是十分保守的。因此，推测切割破坏该位点RNA 序列可能特异性抑制病毒基因的复制与表达。

本研究针对丙型肝炎病毒5'非编码区IRES 位点设计合成LNAzyme，并以阳离子脂质体介导转染HepG2.9706 细胞，采用分子生物学技术分别检测培养上清液中HCV RNA 含量及荧光素酶基因表达情况，观察锁核酸核酶对病毒基因表达的影响，结果显示，DNAzyme、S-DNAzyme 和LNAzyme 对丙型肝炎病毒RNA 复制及荧光素酶基因的表达均有较强的抑制作用，其中，LNAzyme 的抑制作用最强，且随用药时间延长，抑制作用呈增高趋势。此外，MTT比色结果表明，LNAzyme 脂质体混合物对细胞活性基本无影响。总之，针对HCV 5'非编码区IRES 位点的锁核酸核酶，体外能特异性抑制病毒基因调控，为抗丙型肝炎病毒基因治疗提供理论和实验依据，有望成为RNA 病毒基因治疗的新型反义核酸药物。

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［2］Suryawanshi H，Lalwani MK，Ramasamy S，et al.Antagonism of microRNA function in zebrafish embryos by using locked nucleic acid enzymes(LNAzymes)［J］.Chembiochem，2012，13:584-589.

［3］Kaur H，Scaria V，Maiti S.“Locked onto the target”:increasing the efficiency of antagomirzymes using locked nucleic acid modifications［J］.Biochemistry，2010，49:9449-9456.

［4］Donini S，Clerici M，Wengel J，et al.The advantages of being locked.Assessing the cleavages of short and long RNAs by locked nucleic acid-containing 8 － 17 deoxyribozymes［J］.J Biol Chem，2007，282:35510-35518.

［5］邓益斌，温旺荣.反基因锁核酸体外抑制乙肝病毒前S1基因表达［J］.基础医学与临床，2013，33:722-725.

［6］邓益斌，张梁，王燕菲.HBV S 基因的反义锁核酸抑制病毒体外复制［J］.基础医学与临床，2010，30:360-363.

［7］邓益斌，农乐根，黄炜，等.乙型肝炎病毒S/C 基因位点反义锁核酸在小鼠体内抗病毒疗效研究［J］.中华肝脏病杂志，2009，17:900-904.